董睿 劉毅 趙冬梅 楊小萌 張艷卿 蓋忠濤

頰粘膜拭子檢測(cè)孤獨(dú)癥譜系障礙兒童相關(guān)基因多態(tài)性的臨床應(yīng)用

董睿*劉毅*趙冬梅△楊小萌*張艷卿△蓋忠濤*△

目的探討應(yīng)用頰粘膜拭子采集樣本以提取DNA進(jìn)行孤獨(dú)癥譜系障礙（autismspectrumdisorder，ASD）相關(guān)基因檢測(cè)的可行性。方法納入41例ASD患兒。采用棉拭子擦拭患兒頰粘膜，酚-氯仿-異戊醇法抽提基因組DNA；另采集患兒外周靜脈血，用試劑盒提取基因組DNA。比較兩種取材方法獲得的基因組DNA總量、濃度與純度。應(yīng)用PCR-限制性酶切法對(duì)亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetra-hydrofolate reductase，MTHFR）基因C677T位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，比較兩種取材法獲得的基因分型結(jié)果一致性。結(jié)果從頰粘膜提取的基因組DNA總量[（5.87±2.58）μg vs.（2.00±0.92）μg]與濃度[（143.25±72.78）mg/L vs.（66.68±24.43）mg/ L]高于200μL血液提取的基因組DNA（P＜0.01），而純度與血液樣本比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩種取材法進(jìn)行MTHFR基因分型結(jié)果完全一致，并經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)論頰粘膜拭子是一種簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、可靠的獲取基因組DNA方法，可部分替代靜脈血進(jìn)行ASD相關(guān)基因多態(tài)性分析。

頰粘膜拭子 孤獨(dú)癥譜系障礙 基因組DNA 亞甲基四氫葉酸還原酶

孤獨(dú)癥譜系障礙（autismspectrumdisorder，ASD），是一組異質(zhì)性神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病[1]。目前其病因研究主要集中在遺傳學(xué)方面[2]。近期研究報(bào)道ASD發(fā)病與亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetra-hydrofolate reductase，MTHFR）基因多態(tài)性有關(guān)，其C677T位點(diǎn)多態(tài)性增加ASD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[3]。但該方面的研究較少，更缺乏本地區(qū)的研究報(bào)道。從外周血提取基因組DNA是ASD病因研究的主要樣本來(lái)源。但ASD好發(fā)年齡為0～3歲，且患者多伴語(yǔ)言交流障礙，基本不聽(tīng)指令，難以配合采血操作；此外，靜脈取血為有創(chuàng)性操作，伴有一定的創(chuàng)傷與疼痛。因此，尋找一種操作簡(jiǎn)便、無(wú)痛無(wú)創(chuàng)的樣本采集方法是ASD研究亟待解決的問(wèn)題。本研究應(yīng)用頰粘膜拭子擦拭ASD患兒的頰粘膜，然后提取基因組DNA，進(jìn)行MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)，旨在驗(yàn)證此方法在ASD基因多態(tài)性研究中的可行性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2013年8月至2013年12月在山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院兒童保健所確診并參加康復(fù)訓(xùn)練的ASD患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤18歲；②根據(jù)《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ），由經(jīng)驗(yàn)豐富的兒科正高級(jí)職稱(chēng)醫(yī)師確診為ASD。共納入41例ASD患兒，其中男36例，女5例；年齡2.0～5.8歲，平均（3.50±0.83）歲。本研究方案經(jīng)山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)論證通過(guò)，所有樣本采集均得到患兒父母或其他監(jiān)護(hù)人的同意。

1.2 研究方法

1.2.1 采集頰粘膜樣本并提取DNA 采集樣本前患兒禁食1 h或生理鹽水漱口，以避免食物殘?jiān)烊?。采用一次性醫(yī)用棉簽（諸暨市康偉醫(yī)療衛(wèi)生用品廠）擦拭患兒雙側(cè)頰粘膜至少5次。采集時(shí)動(dòng)作輕柔，擦拭稍有力度，避免引起患兒不適及粘膜損傷。取材后將棉拭子置于1 mL生理鹽水中洗滌，離心沉淀。應(yīng)用傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇法提取基因組DNA，以40μL TE緩沖液重溶。

1.2.2 采集外周血樣本并提取DNA 抽取ASD患兒肘部靜脈血1～2 mL，經(jīng)EDTA抗凝，于-80℃凍存。應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物技術(shù)公司），取200μL血液樣本，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取血液基因組DNA，最終獲得40μL的基因組DNA洗脫液。

1.2.3 測(cè)定DNA濃度、純度與總量 頰粘膜和血液樣本基因組DNA提取后，應(yīng)用核酸蛋白含量測(cè)定儀（EPENDOFF）和瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定其DNA總量、濃度和純度。純度用吸光度（260/280比值）表示。

頰粘膜和血液基因組DNA置于-20℃凍存，1個(gè)月后取出復(fù)測(cè)濃度及純度，并行瓊脂糖凝膠電泳查看片段有無(wú)斷裂或降解。

1.2.4 PCR擴(kuò)增DNA 以頰粘膜和血液樣本基因組DNA為模板，檢測(cè)MTHFR基因677位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。通過(guò)查閱文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)確定MTHFR基因C677T引物：上游，5’-GCC TCT CCT GAC TGT CAT CC-3’；下游，5’-CAC TCT CAC CGC ACC GTC CT-3’，擴(kuò)增片段282bp。由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25μL：10×緩沖液2.5μL，0.2 mmol/L dNTP，上游引物和下游引物各2μmol/L，Taq酶0.2μL，模板DNA 1μL。基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.2.5 限制性?xún)?nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物 MTHFR C677T基因型由限制性核酸內(nèi)切酶HinfI（美國(guó)NEB公司）進(jìn)行酶切。酶切體系10μL：HinfI內(nèi)切酶1μL，10×H緩沖液1μL，PCR產(chǎn)物3μL。37℃水浴3 h，2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

在內(nèi)切酶Hinf I的作用下，MTHFR基因PCR產(chǎn)物C677T基因型可分為三種：野生型CC（長(zhǎng)度為282 bp）、雜合突變型CT（長(zhǎng)度分別為282 bp、176 bp和106 bp）和純合突變型TT（長(zhǎng)度分別為176 bp和106 bp）。

1.2.6 基因測(cè)序 隨機(jī)抽取9例頰粘膜PCR產(chǎn)物，Sanger測(cè)序法測(cè)定PCR擴(kuò)增片段的堿基序列（上海英駿生物技術(shù)有限公司），驗(yàn)證PCR-限制性酶切所得的基因型。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩種取材法所得基因組DNA濃度、總量與純度，以及凍存前后基因組DNA濃度、總量與純度，并比較PCR-限制性酶切法與Sanger測(cè)序法所測(cè)MTHFR基因型是否一致。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA濃度、總量與純度從頰粘膜細(xì)胞提取的基因組DNA與從血液提取的基因組DNA總量分別為（5.87±2.58）μg和（2.00±0.92）μg；濃度分別為（143.25±72.78）mg/L和（66.68±24.43）mg/L；純度分別為（1.63±0.15）和（1.62±0.30）。

從頰粘膜細(xì)胞提取的基因組DNA總量（t= 6.37，P＜0.01）、濃度（t=6.37，P＜0.01）均高于從200 μL血液提取的基因組DNA，兩者純度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.33，P=0.74）。頰粘膜細(xì)胞與血液提取的基因組DNA電泳結(jié)果示，兩種取材所獲DNA條帶明亮清晰，大小一致，無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

復(fù)測(cè)凍存的頰粘膜和血液基因組DNA，濃度分別為（138.47±65.00）mg/L和（66.30±23.21）mg/L；純度分別為（1.62±0.15）和（1.64±0.29）。與凍存前比較，頰粘膜樣本濃度（t=1.19，P=0.24）、純度（t＝0.82，P=0.42）和血液樣本濃度（t=1.22，P=0.23）、純度（t=0.07，P=0.94）均無(wú)明顯差異，電泳也未見(jiàn)明顯降解。

2.2 MTHFR C677T基因型在41例ASD患兒中，CC基因型表達(dá)者為9例，CT基因型26例，TT基因型6例，CT和TT為突變基因型，突變率為78.0%。見(jiàn)圖2。

2.3 基因測(cè)序結(jié)果9例PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，其結(jié)果與PCR-限制性?xún)?nèi)切酶酶切-電泳圖譜基因分型結(jié)果完全一致。見(jiàn)圖3。

3 討論

早期家系和雙生子研究證實(shí)，遺傳因素在ASD發(fā)生中發(fā)揮重要作用[4]。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)多種ASD相關(guān)易感基因，這些基因與環(huán)境因素相互作用，共同導(dǎo)致疾病發(fā)生。ASD等許多疾病的研究多采用外周靜脈血中白細(xì)胞作為基因組DNA來(lái)源，但靜脈采血存在多種弊端：首要的是采血給嬰幼兒帶來(lái)一定痛苦和傷害，多數(shù)家長(zhǎng)對(duì)采血等有創(chuàng)操作存在抵觸心理，且ASD患兒年齡段、癥狀表現(xiàn)特殊，極難配合采血操作，這給樣本采集和重復(fù)取樣帶來(lái)很大難度[5]；在大樣本的流行病學(xué)研究中，研究對(duì)象通常分散在全國(guó)，而靜脈穿刺需要訓(xùn)練有素的工作人員，這使得收集血液樣本非常困難。理論上說(shuō)，任何有核細(xì)胞都可作為基因組DNA的來(lái)源。曾有研究比較口腔細(xì)胞刷、頰粘膜拭子、漱口等多種收集基因組DNA的方式，結(jié)果示從漱口水中提取的DNA產(chǎn)量相對(duì)最高[6]。但在實(shí)際操作中，ASD患兒年齡小，難以配合指令，因此漱口法不適合作為ASD遺傳研究的DNA采集方法。國(guó)外有研究表明，頰粘膜拭子在人群中的接納率為80%，明顯高于血液（31%）和唾液（72%）采集的接納率[7]。本研究也發(fā)現(xiàn)相對(duì)于采血，家長(zhǎng)和患兒更易接納采集頰粘膜樣本。

圖1 兩種取材方法所獲基因組DNA的電泳圖A為部分患兒頰粘膜樣本基因組DNA電泳圖；B為相應(yīng)血液樣本基因組DNA電泳圖

圖2 兩種取材方法所獲基因組DNA樣本PCR、酶切結(jié)果A為部分患兒頰粘膜樣本酶切結(jié)果；B為相應(yīng)血液樣本酶切結(jié)果

圖3 頰粘膜樣本PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果A、B、C、D為正向測(cè)序結(jié)果；E、F為反向測(cè)序結(jié)果。其中A為基因型TT，B為基因型CT，C為基因型CT，D為基因型CT，E為基因型CT（反向測(cè)序結(jié)果AG），F(xiàn)為基因型為CT（反向測(cè)序結(jié)果AG）

健康人的口腔中有數(shù)百種微生物[8]，頰粘膜拭子采集的樣本中含有相當(dāng)數(shù)量的細(xì)菌、真菌或病毒。但Baechtel等[9]認(rèn)為細(xì)菌和真菌并不干擾人類(lèi)DNA模板的擴(kuò)增反應(yīng)。程家蓉等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明食物也并不干擾人基因組DNA的擴(kuò)增，該研究提取口腔、血液和人常食用的動(dòng)植物（米飯、青菜、豬牛肉等）DNA，發(fā)現(xiàn)口腔、血液樣本均能擴(kuò)增出Alu、NAT2、GSTM1等基因片段，所有食物DNA全部未能擴(kuò)增。本研究也表明，頰粘膜細(xì)胞基因組DNA擴(kuò)增出的基因帶型單一、清晰，未出現(xiàn)基因組DNA條帶斷裂、降解或非特異性條帶等情況，其濃度明顯優(yōu)于從200 μL血液中提取的DNA，純度與血液樣本相當(dāng)，說(shuō)明從頰粘膜獲得DNA是完全可行的。

本研究發(fā)現(xiàn)于-20℃凍存的頰粘膜、血液基因組DNA與新鮮提取的樣本相比，濃度及純度均無(wú)明顯改變，電泳也未見(jiàn)明顯降解情況。國(guó)內(nèi)也有相似報(bào)道：通過(guò)頰粘膜拭子一次性采集的DNA，保存時(shí)間1個(gè)月時(shí)測(cè)DNA總量為1.0～1.5 μg，保存1年后測(cè)總量為0.8～1.3 μg，保存2年時(shí)約為0.7～1.3 μg[11]。這表明頰粘膜DNA同血液DNA一樣可長(zhǎng)期儲(chǔ)存，而不影響基因組DNA質(zhì)量與后期檢測(cè)。應(yīng)用PCR-限制性酶切法分析MTHFR基因C677T多態(tài)性，結(jié)果顯示電泳條帶清晰、明亮，基因型明確，且與血液基因組DNA的結(jié)果完全一致。有研究將頰粘膜拭子法應(yīng)用在藥物性耳聾基因、CHRNA3基因多態(tài)性分析中，均得到滿(mǎn)意結(jié)果[12-13]。

綜上，采集頰粘膜DNA相對(duì)于外周血具有簡(jiǎn)便、高效、廉價(jià)等諸多優(yōu)點(diǎn)，被證實(shí)可用于ASD基因多態(tài)性等諸多研究，可有效地解決分子遺傳學(xué)研究樣本采集困難、反復(fù)取樣受限等問(wèn)題，具有較高的推廣價(jià)值和普及價(jià)值。但在基因多態(tài)性位點(diǎn)研究以外領(lǐng)域，如核型分析、基因芯片等，頰粘膜DNA的應(yīng)用尚處于空白階段，仍需進(jìn)一步探索。

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The application of buccal mucosa swab in analysis of gene polymorphismin children with ASD.

DONG Rui, LIU Yi,ZHAO Dongmei,YANG Xiaomeng,ZHANG Yanqing,GAI Zhongtao.Jinan Pediatric Research Institute and Key Laboratory of Pediatric Medicine,Jinan Pediatric Health Institute,Shandong Provincial AutismRehabilitation Center,Qilu Children’s Hospital of Shandong University,Jinan 250022,China.Tel：0531-81309011.

ObjectiveTo investigate the feasibility of buccal mucosa swab method to isolate genomic DNA for autismspectrumdisorders(ASD)-related genetic screening.MethodsBuccal mucosa swabs and blood were collected from41 children with ASD.Genomic DNA was extracted fromeither blood by using a commercial genomic DNA kit or buccal mucosa swab by using phenol-chloroform-isoamyl alcohol method.The concentration,total quality and purity of genomic DNA were compared between these two methods.Genotyping of the ASD-related methylenetetra-hydrofolate reductase (MTHFR)gene C677T locus was analyzed using PCR-restriction enzymatic digestion and sanger sequencing was performed forvalidation.ResultsThe total quality[(5.87±2.58)μg vs.(2.00±0.92)μg]and concentration[(143.25±72.78)mg/ L vs.(66.68±24.43)mg/L]of genomic DNA extracted frombuccal mucosa swab were higher than that formblood(P＜0.05), while the purity was not significantly different between these two methods(P＞0.05).Genotyping analysis of MTHFR was also consistent between these two methods.ConclusionBuccal mucosa swab is a simple,non-invasive and reliable method to obtain genomic DNA,which can partially rep lace blood for analysis of ASD-related gene polymorphisms.

Buccal mucosa swab Autismspectrumdisorder Genomic DNA MTHFR

R749.94

A

2014-03-04）

（責(zé)任編輯：肖雅妮）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.07.009

*山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院兒童研究所（濟(jì)南250022）

△山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院，山東省孤獨(dú)癥兒童康復(fù)中心