羅永會，張翠香，徐春萍，左紹遠(yuǎn)，劉云春

(大理學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ，云南 大理 671000)

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海棠果中總黃酮的含量測定

羅永會，張翠香，徐春萍，左紹遠(yuǎn)，劉云春

(大理學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ，云南 大理 671000)

目的：建立海棠果中總黃酮的含量測定方法。方法：以蘆丁為對照品，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色，采用分光光度法測定海棠果中總黃酮的含量。結(jié)果：海棠果中總黃酮的含量為10.04%，精密度實驗RSD為0.78%；穩(wěn)定性實驗RSD為2.30%,在90min內(nèi)穩(wěn)定性較好；重復(fù)性實驗RSD為0.69%；蘆丁對照品濃度在0～100μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為:Y= 0.010 9X-0.001 2，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 8；平均加樣回收率為98.71% ，RSD為1.38%。結(jié)論：該方法簡便、穩(wěn)定，可用于海棠果中總黃酮的含量測定。

海棠果；總黃酮；蘆??；含量測定

黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，廣泛存在于蔬菜、水果及藥用植物中，是植物在長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物,具有抗炎、抗病毒、利膽、強心、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛以及降壓、降血脂、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[1-4]。近年來黃酮類化合物成為新藥開發(fā)研究中一個非常重要的資源，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

海棠果(Malus prunifolia)又名楸子、海紅、紅海棠果、柰子，屬薔薇科(Ro-saceae)、蘋果亞科(Maloideae)，落葉小喬木[5]。原產(chǎn)我國，現(xiàn)主要分布在華北、河北、東北南部，內(nèi)蒙古及西北也有。云南西北部的大理、麗江等地區(qū)亦有種植。民間認(rèn)為：海棠果能解毒生津，健胃止渴，降火利尿，助消化，預(yù)防和治療便秘，對小兒尿道炎有特效，是一種純正的天然保健珍品，長期食用海棠果產(chǎn)品有健腦、增強免疫力、抗疲勞等作用，尤其是具有抗腫瘤作用[6-8]。但有關(guān)海棠果總黃酮的研究尚未見報道，本研究采用單因子試驗和正交試驗對提取海棠果總黃酮的最佳條件進行探索，并對其含量進行測定，為進一步開發(fā)海棠果提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料和試劑

海棠果購于云南麗江市古城農(nóng)貿(mào)市場。蘆丁、石油醚(沸程60～90℃)、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 主要儀器

BT-224S型電子分析天平( 德國賽多利斯儀器公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；TDL-4A低速離心機(上海菲恰爾儀器有限公司)；722E分光光度計(上海分析儀器有限公司)；RA-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；中藥粉碎機。

1.3 樣品預(yù)處理

海棠果果干于60℃干燥24h，粉碎。加入10倍體積的石油醚，65℃水浴回流2h，重復(fù)2次，脫脂及去除色素，室溫?fù)]干有機溶劑，干燥得脫脂海棠果粉樣品，備用。

2 方法與結(jié)果[9-16]

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取120 ℃干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100.0mg，用50%乙醇定容至100mL，則蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為1.0mg/mL，準(zhǔn)確吸取對照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，置于10mL試管中，分別加50%乙醇至2.0mL混勻，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL混勻，放置6min，加10%的硝酸鋁溶液0.3mL混勻，放置6min后加5%的氫氧化鈉溶液2.0mL，混勻，放置15min加50%乙醇至10.0mL混勻，以第1管為空白對照，于510nm處測定吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(510nm)

求得回歸方程為:Y= 0.010 9X-0.001 2，R2=0.999 8。蘆丁對照品濃度在0 ～ 100 μg /mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 海棠果總黃酮提取方法的確定

通過對提取溶劑的濃度、料液比、溫度、時間等單因素實驗，對主要的提取影響因素進行考察。結(jié)果如下。

2.2.1 料液比對黃酮含量的影響 采用65%的乙醇，分別以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶60、1∶100料液比，40℃提取1.5h，提取1次，測定總黃酮含量，結(jié)果如圖2，隨料液比的增加，總黃酮的含量也隨之增大，料液比為1∶60時達(dá)到最大為7.54%，故海棠果總黃酮提取的最佳料液比為1∶60。

圖2 黃酮含量與料液比的關(guān)系

2.2.2 溫度度對總黃酮含量的影響 按1∶60料液比，采用65%的乙醇，分別以20、40、60、70、80、90、100℃為提取溫度，提取1.5h，提取1次，測定總黃酮含量，結(jié)果如圖3，隨溫度的升高，總黃酮的含量隨之增大，溫度達(dá)到80℃時，含量達(dá)到最大，之后則隨溫度的升高反而降低。故海棠果總黃酮的提取溫度選擇80℃。

圖3 黃酮含量與提取溫度的關(guān)系

2.2.3 浸提時間對總黃酮含量的影響 采用65%的乙醇按1∶60的料液比，80℃分別提取0.5、1.0、1.5、 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，提取1次，測定總黃酮含量，結(jié)果如圖4。隨時間增長，海棠果總黃酮的含量有所增加，當(dāng)提取時間為3h時，達(dá)到最大含量9.65%，之后隨時間增長則降低。故海棠果提取的時間為3h。

圖4 黃酮含量與提取時間的關(guān)系

2.2.4 乙醇濃度對總黃酮含量的影響 分別用0%(去離子水)、20%、30%、40%、50%、65%、80%、95%乙醇濃度，按料液比為1∶60(g/mL)，40 ℃提取3.0 h，提取1次，測定總黃酮含量，結(jié)果如圖5，隨乙醇濃度的增加總黃酮含量隨之增大，當(dāng)乙醇濃度增加到50%時，海棠果總黃酮含量達(dá)到最大為9.92%，之后則隨乙醇濃度的增加，總黃酮含量則反而降低。故黃酮提取的乙醇濃度為50%。

圖5 黃酮含量與乙醇濃度的關(guān)系

綜合上述實驗結(jié)果，從料液比、浸提溫度、乙醇濃度、浸提時間四個因素綜合考慮，選擇料液比為1∶60(g/mL)、浸提溫度為80℃、50%乙醇為浸提劑、浸提時間為3.0h，提取海棠果中的總黃酮，可得到較好的效果。

2.2.5 海棠果總黃酮提取液的制備及含量測定 準(zhǔn)確稱取1.00g脫脂海棠果粉，按1∶60(g/mL)料液比，用50%乙醇為浸提劑,80℃浸提3.0h，過濾，用50%乙醇溶液定容到100mL，得總黃酮提取液，備用。準(zhǔn)確吸取1.0mL置于50mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容到刻度。吸取2.0mL，按照“2.1”方法操作，于510nm處讀取吸光度,代入線性回歸方程，求出樣品液中總黃酮濃度，計算海棠果中總黃酮的含量約為10.04%。

海棠果中總黃酮的含量=C×V×N×10-6/M×100%

其中：C：樣品總黃酮濃度(μg/mL)，M：海棠果干粉質(zhì)量(g)，V：待測樣品總體積(mL)，N：待測溶液的稀釋倍數(shù)，10-6：單位換算(1g=10-6μg)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 精密吸取總黃酮提取液2.0mL，共5份，按“2.1”項方法操作，在510nm波長處測定吸光度，計算總黃酮含量，RSD=0.78%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果 (n=5)

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取總黃酮提取液2.0mL，按“2.1”項方法操作，分別放置于室溫0、15、30、60、90min之后，在510nm波長處測定吸光度，RSD=2.30%，表明其在顯色后的90min內(nèi)穩(wěn)定性較好。結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果 (n=5)

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取脫脂海棠果粉1.00 g，共5份，按“2.2.5”項方法提取總黃酮，按“2.1”項方法操作，分別在510 nm波長處測定吸光度，計算總黃酮含量， RSD=0.69%，表明試驗的重復(fù)性良好。結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗 (n=5)

2.3.4 加樣回收率試驗 精密稱取脫脂海棠果粉5份，每份為0.5 g，分別加入1.0 mg/mL蘆丁1.0 mL，按“2.2.5”項方法提取總黃酮，按“2.1”項方法操作，分別在510nm波長處測定吸光度，平均回收率為98.71%，RSD=1.38%，表明測定方法可靠性強。結(jié)果見表4。

3 討論

本實驗通過對提取溶劑濃度、料液比、溫度及提取時間等單因素進行實驗，建立了海棠果總黃酮的提取方法：以1∶60的料液比用50%乙醇在80 ℃浸提3.0h。以蘆丁為對照品，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色，采用分光光度法測定海棠果中總黃酮的含量。精密度實驗RSD為0.78%；穩(wěn)定性實驗RSD為2.30%,在90min內(nèi)穩(wěn)定性較好；重復(fù)性實驗RSD為0.69%；平均加樣回收率為98.71% ，RSD為1.38%。該方法簡便、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，為海棠果的開發(fā)利用奠定了一定基礎(chǔ)。海棠果中含有豐富的總黃酮，平均含量達(dá)10.04%，具有較高的研究價值。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Determination Total Content of Flavonoids from Chinese Flowering Crabapple

Luo Yonghui, Zhang Cuixiang, Xu Chunping，Zuo Shaoyuan，Liu Yunchun

(Pre-clinical College，Dali University, Yunnan 671000, China)

Objective:To establish the method of determination the total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple.Methods:Taking rutin as the standard sample and colored by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH solution, the total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple was determined by the spectrophotometric method.Results:The total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple was 10.04%. The RSDs of the precision test, the stability test and the repetitive test were 0.78% , 2.30% and 0.69% respectively. There was a better linear relation with the concentration of rutin standard in the range of 0～100μg/mL. The regression equation wasY=0.010 9X-0.001 2, and the square of correlation coefficient R2=0.9998. The average recovery rate was 98.71% (RSD=1.38%).Conclusion:The method is simple and stable, and may be used to determine the total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple.

Chinese Flowering Crabapple; Total Flavonoids; Rutin; Content Determination

2014-01-07

羅永會(1967-)，女，白族，大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗師，研究方向為生物化學(xué)實驗教學(xué)和植物成分的提取。

R284.2

A

1673-2197(2014)09-0020-03