鄧潔雄，肖洋娟，顏惠芳

(1.廣州市藥品檢驗(yàn)所 四分所，廣東 廣州 510405；2.廣州市荔灣區(qū)骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州510140)

?

高效液相色譜法測(cè)定米非司酮血藥濃度

鄧潔雄1，肖洋娟1，顏惠芳2

(1.廣州市藥品檢驗(yàn)所 四分所，廣東 廣州 510405；2.廣州市荔灣區(qū)骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州510140)

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定血漿中米非司酮的濃度。方法：采用固相萃取技術(shù)處理血漿樣品，以炔諾酮為內(nèi)標(biāo)，Phenomenex Synergi 4u Fusion-RP 80A C18柱(4.6mm×250mm，4μm)為分析柱，流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25)，流速1.0mL·min-1，柱溫：25℃。采用雙波長(zhǎng)法檢測(cè)，炔諾酮的檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm，米非司酮檢測(cè)波長(zhǎng)為302nm。結(jié)果：米非司酮的線性范圍為0.01～2.0μg·mL-1，最低定量限為0.01μg·mL-1，回歸方程為Y=1.6439X-0.0297，r=0.9998。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，適用于米非司酮藥代動(dòng)力學(xué)研究。

米非司酮；血藥濃度；固相萃??；內(nèi)標(biāo)法；高效液相色譜法

米非司酮(mifepristone)是一種甾體類(lèi)抗孕激素藥物，臨床廣泛應(yīng)用于終止早孕、引產(chǎn)等[1]。目前報(bào)道的有關(guān)血漿中米非司酮濃度測(cè)定的方法有放射性免疫測(cè)定法(RIA)[2]、放射性受體測(cè)定法(RRA)[3]、高效液相色譜法(HPLC)[4]。RIA和RRA方法無(wú)法區(qū)分米非司酮母體和代謝物，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜、危險(xiǎn)、成本高，因此這兩種方法的使用受到限制。在報(bào)道的HPLC方法中，國(guó)內(nèi)有研究[4-5]采用乙醚萃取方法處理樣本，由于乙醚提取的樣品中血漿內(nèi)源性雜質(zhì)太多，干擾米非司酮測(cè)定；國(guó)外有研究報(bào)道，Stith等[6]采用固相萃取技術(shù)測(cè)定米非司酮血藥濃度，但該方法所用內(nèi)標(biāo)物RTI-3021-003難以獲得，另有國(guó)外文獻(xiàn)[7]以炔諾酮為內(nèi)標(biāo)，采用固相萃取技術(shù)測(cè)定血漿中米非司酮濃度，其炔諾酮與血漿內(nèi)源性物質(zhì)分離效果差，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究通過(guò)優(yōu)化固相萃取方法中清洗步驟，消除了血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)米非司酮及炔諾酮測(cè)定的干擾，建立了一種專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高的HPLC方法測(cè)定血漿中米非司酮濃度，為藥代動(dòng)力學(xué)研究和生物等效性評(píng)價(jià)提供了可靠的保證。

1 材料和對(duì)象

1.1 儀器

日本Shimadzu公司LC-20AT泵，SIL-20A全自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，LC-Solution工作站；德國(guó)IKA MS2渦旋混合器；TCL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；固相萃取儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Oasis HLB固相萃取小柱(1cc/30mg)由Waters公司提供。

1.2 藥品和試劑

炔諾酮對(duì)照品(100053-200705)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；米非司酮原料藥由浙江仙琚制藥股份有限公司提供，批號(hào)：100131；米非司酮普通片劑(規(guī)格：10mg)由北京紫竹藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：43090105；甲醇為色譜純(SK Chemicals)，磷酸為分析純(天津富宇精細(xì)化工有限公司)，水為重蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性Spague-Dawley大鼠，體重(200±20)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Synergi 4u Fusion-RP 80A C18柱(4.6mm×250mm，4μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(75∶25)；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：炔諾酮采用240nm，米非司酮采用310nm，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：30μL。

3 樣品處理

3.1 對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備

對(duì)照品溶液的配制：精密稱取10mg米非司酮置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到米非司酮對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液0.025、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5.0mL置于50mL量瓶中，用0.025%磷酸稀釋至刻度，得濃度分別為0.05、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取10mg炔諾酮置于100mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得炔諾酮對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1.25mL置于50mL量瓶中，用0.025%磷酸稀釋至刻度，配成2.5μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

3.2 血漿樣品處理

HLB小柱用1mL甲醇進(jìn)行活化，1mL重蒸餾水平衡，備用。取血漿樣品150μL加入內(nèi)標(biāo)溶液30μL，渦旋2min，加入1mol·L-1磷酸30μL，渦旋2min，靜置5min后上樣。用3mL重蒸餾水清洗小柱，再用1mL 0.5%甲醇清洗小柱1次，棄去清洗液。最后用1mL甲醇洗脫樣品，洗脫液置于50℃真空干燥箱中揮干。洗脫液揮干后用100μL 50%甲醇溶解，渦旋2min， 16 000rpm離心4min，取上清液進(jìn)樣。

4 方法與結(jié)果

4.1 方法專(zhuān)屬性

在上述色譜條件下測(cè)得空白血漿及空白血漿加樣色譜，見(jiàn)圖1。內(nèi)標(biāo)炔諾酮、米非司酮的保留時(shí)間分別為7.2、13.6 min，結(jié)果表明血漿中無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾炔諾酮及米非司酮。

圖1 米非司酮+炔諾酮溶液(A)、空白血漿(B)、空白血漿+米非司酮+炔諾酮(C)、大鼠給藥后血漿樣品(D)色譜

4.2 線性關(guān)系及靈敏度

取大鼠空白血漿150μL，加入不同濃度的米非司酮系列對(duì)照品溶液30μL及內(nèi)標(biāo)溶液30μL，使血漿中米非司酮的濃度分別為0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0μg·mL-1，內(nèi)標(biāo)炔諾酮濃度為0.5μg·mL-1。自“加入1mol·L-1磷酸30μL”，按“3.2”項(xiàng)下方法操作，以血漿中米非司酮的濃度為橫坐標(biāo)，米非司酮與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=1.6439X-0.0297，r=0.9998，定量下限為0.01μg/mL-1，結(jié)果表明米非司酮在0.01～2.0μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4.3 絕對(duì)回收率

按“4.2”項(xiàng)下方法制備米非司酮低、中、高(0.05、0.5、2.0μg·mL-1)三個(gè)濃度的對(duì)照品血漿質(zhì)控樣本(QC)，每個(gè)濃度平行制備5份樣品，自“加入1mol·L-1磷酸30μL”，按“3.2”項(xiàng)下操作處理后進(jìn)樣，記錄米非司酮的峰面積為As。另取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用0.025%磷酸稀釋成相應(yīng)濃度的米非司酮溶液，不經(jīng)處理直接進(jìn)樣，記錄米非司酮的峰面積為Asd。血漿中米非司酮的絕對(duì)回收率=As/Asd×100%。按公式計(jì)算低、中、高三個(gè)濃度下血漿中米非司酮的絕對(duì)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血漿中米非司絕對(duì)回收率 (n=5)

4.4 精密度和準(zhǔn)確度

按“4.2”項(xiàng)下方法制備米非司酮低、中、高三個(gè)濃度(0.05、0.5、2.0μg·mL-1)質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度平行制備6份樣品，自“加入1mol·μL-1磷酸30μL”，按“3.2”項(xiàng)下操作處理后進(jìn)樣，連續(xù)測(cè)定3天并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣本的濃度，精密度以實(shí)際測(cè)得量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示，計(jì)算日內(nèi)RSD和日間RSD。準(zhǔn)確度以質(zhì)控樣品實(shí)測(cè)濃度值與理論濃度值之比計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 米非司酮的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度 (%)

4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

4.5.1 室溫穩(wěn)定性 按“4.2”項(xiàng)下方法制備米非司酮低、中、高三個(gè)濃度(0.05、0.5、2.0μg·mL-1)質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度平行制備3份樣品，于室溫分別放置不同時(shí)間后，自“加入1mol·L-1磷酸30μL”，按“3.2”項(xiàng)下操作處理后進(jìn)樣，與0h相比求得血漿樣本的RSD為3%。結(jié)果表明，對(duì)照品血漿質(zhì)控樣本在8h內(nèi)可保持穩(wěn)定。

4.5.2 凍融穩(wěn)定性 按“4.2”項(xiàng)下方法制備米非司酮低、中、高三個(gè)濃度(0.05、0.5、2.0μg·mL-1)質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度平行制備3份樣品，于-20℃冷凍24h，取出解凍，反復(fù)凍融3次后，自“加入1mol·L-1磷酸30μL”，按“3.2”項(xiàng)下操作處理后進(jìn)樣，與未凍融前相比求得標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本的RSD為3.6%。結(jié)果表明，對(duì)照品血漿質(zhì)控樣本在凍融條件下可保持穩(wěn)定。

4.5.3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性 按“4.2”項(xiàng)下方法制備米非司酮低、中、高三個(gè)濃度(0.05、0.5、2.0μg·mL-1)質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度平行制備3份樣品，于-20℃分別冷凍7、14、21天后取出待完全解凍后，自“加入1mol·L-1磷酸30μL”，按“3.2”項(xiàng)下操作處理后進(jìn)樣，與0h相比求得對(duì)照品血漿質(zhì)控樣本的RSD為4.8%。結(jié)果表明，對(duì)照品血漿質(zhì)控樣本在-20℃條件下可保持21天穩(wěn)定。

4.6 樣品血藥濃度測(cè)定

取米非司酮片劑10片，碎成細(xì)顆粒，備用。取禁食12h的SD大鼠6只，按照5.2mg/kg劑量經(jīng)特制灌胃針灌胃，試驗(yàn)期間自由飲水，給藥后4h給予食物。分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h眼眶后靜脈叢取血0.5mL，置肝素化離心管中，4 000rpm離心10min，分離血漿，于-20℃下保存，直至分析。按“3.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，各取樣時(shí)間點(diǎn)的平均血藥濃度為240.14、292.77、155.03、83.28、52.73、47.44、43.29、38.41ng·mL-1，其SD分別為7.76%、9.38%、4.14%、2.61%、1.31%、0.41%、0.43%、0.41%，以取樣時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，血藥濃度為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠灌胃米非司酮后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

5 討論

5.1 固相萃取條件的選擇

加入血漿中的米非司酮對(duì)照品溶液及炔諾酮內(nèi)標(biāo)溶液若采用甲醇稀釋定容，會(huì)產(chǎn)生蛋白沉淀，使樣品通過(guò)固相萃取小柱變得極為困難，故不采用甲醇稀釋工作液。由于米非司酮難溶于水，在酸性條件下易溶解，因而采用0.025%的磷酸水溶液(pH值約為2.4)來(lái)稀釋定容對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液。

為保證被分析物的高回收率并盡可能除去血漿內(nèi)源性物質(zhì)，試驗(yàn)過(guò)程中考察了幾種清洗液：水、5%的甲醇溶液、30%的甲醇溶液、5%甲醇-2%乙酸溶液、5%甲醇-2%氨水溶液對(duì)萃取結(jié)果的影響。結(jié)果表明加大清洗液中有機(jī)相的比例，并不能減少待測(cè)物質(zhì)出峰位置的雜質(zhì)干擾，反而導(dǎo)致部分待測(cè)物質(zhì)在洗脫前已經(jīng)被清洗出來(lái)，降低樣品回收率。此外，在5%甲醇中添加一定比例的乙酸或氨水，其清洗效果也未有明顯提高。本研究還對(duì)水的清洗量進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加水的清洗量，能更好地降低雜質(zhì)干擾。最后采用以3mL水、1mL0.5%甲醇依次清洗，1mL甲醇洗脫的方法。結(jié)果表明，血漿內(nèi)源性物質(zhì)與炔諾酮及米非司酮分離度良好，對(duì)炔諾酮及米非司酮的測(cè)定無(wú)干擾，萃取物的絕對(duì)回收率高，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

5.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

本研究采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)方法，以內(nèi)標(biāo)法定量分析，提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。試驗(yàn)過(guò)程中，還對(duì)使用左炔諾孕酮和炔諾酮作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果顯示，左炔諾孕酮主峰位置與血漿內(nèi)源性物質(zhì)分離度較差，而采用炔諾酮為內(nèi)標(biāo)，與血漿內(nèi)源性物質(zhì)分離度好，故選用炔諾酮作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

5.3 色譜條件的選擇

本試驗(yàn)對(duì)比了甲醇-0.2%甲酸溶液(75∶25)、甲醇-0.1%甲酸溶液(75∶25)、和甲醇-水(75∶25)三種流動(dòng)相的分離效果。發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，炔諾酮與米非司酮的保留時(shí)間大大縮短，與血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)分離度差，而采用甲醇-水(75∶25)為流動(dòng)相在保證分析時(shí)間不是太長(zhǎng)的同時(shí)能實(shí)現(xiàn)炔諾酮、米非司酮與血漿內(nèi)源性物質(zhì)的良好分離。

5.4 方法適用性

本研究建立的米非司酮血漿濃度測(cè)定方法，具有操作簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，可滿足體內(nèi)藥物濃度測(cè)定，適用于米非司酮藥代動(dòng)力學(xué)的研究。

[1] BAULIEU EE，SEGAL SJ.The antiprogestin steroid RU 486 and human fertility control[M].New York: Plenum Press，1985：1.

[2] WANG JD， SHI WL， ZHANG GQ， et al.Tissue and serum levels of steroid hormones and RU 486 after administration of mifepristone[J]. Contraception，1994，49( 3) ：245.

[3] KAWAI S，NIEMAN L，BRANDON D，et al.Pharmacokinetic properties of the antiglucocorticoid and antiprogesterone steroid RU 486 in man[J].Pharmacol ExpTher，1987，241( 2)：401.

[4] GUO ZHIYONG，WEI DANYI，CHU CHENGDING，et al.Determination of mifepristone in human plasma by high performance liquid chromatography[J].PTCA ( PART B:CHEM.ANAL)，2007，43(1)：15.

[5] WU LIHUA，SHENTU JIANZHONG，ZHANG XIA，et al.Determination of mifepristone in plasma by high performance liquid chromatograph[J].Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2003，20(1)：65.

[6] STITH C，HUSSAIN MD.Determination of mifepristone levels in wild canid serum using liquid chromatography[J].Journal of Chromatography B，2003，794(1)：9.

[7] GUO ZY，WANG S，WEI DY，et al.Development of a high-performance liquid chromatographic method for the determination of mifepristone in human plasma using norethisterone as an internal standard: application to pharmacokinetic study[J].Contraception，2007，76(1)：228.

(責(zé)任編輯：姜付平)

Determination of mifepristone in plasma using HPLC method

Deng Jiexiong， Xiao Yangjuan，Yan Huifang

(1.Guangzhou Fourth Substation Institute For Drug Control， Guangzhou 510405，China；2.Liwan District Orthopedics Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510140 China)

Objective:A convenient HPLC method was developd to determine the concentration of mifepristone in plasma.Methods:Solid-phase extration cartridges were used to extract plasma samples .Separation was carried out on a Phenomenex Synergi 4u Fusion-RP 80A C18(4.6mm×250mm，4μm)column maintained at 25℃ with methanol-water(75∶25) as mobile phase at a flow rate of 1.0mL·min-1.Norethisterone was employed as the internal standard. Dual wavelength was used， with norethisterone monitored at 240 nm and mifepristone at 302 nm.Results:The linearity range of mifepristone was 0.01～2.0μg·mL-1and the lowest limit of quantification was 0.01μg·mL-1， the regressive equation was Y = 1.6439X-0.0297，r=0.9998.Conclusion:The method was simple， accurate and sensitive. And it could be applied to study on the pharmacokinetics of mifepristone.

Mifepristone; Plasma Drug Concentration;Solid-Phase Extraction; Internal Standard; HPLC

2014-03-19

鄧潔雄(1962-)，女，廣州市藥品檢驗(yàn)所四分所主管藥師，研究方向?yàn)樗幬锓治觥?/p>

R284

A

1673-2197(2014)11-0019-03