游秋云 王平 張舜波 黃攀攀 章程鵬

·基礎(chǔ)研究·

酸棗仁湯對GABAB1R介導(dǎo)快動眼睡眠剝奪老年大鼠下丘腦室旁核cAMP-PKA-CREB信號通路的影響

游秋云 王平 張舜波 黃攀攀 章程鵬

目的觀察酸棗仁湯對快動眼睡眠被剝奪老年大鼠下丘腦室旁核（PVN）cAMP-PKA-CREB信號通路的影響。方法將自然衰老24月齡Wistar大鼠隨機分成空白對照組（等容生理鹽水），老年REM睡眠剝奪組（等容生理鹽水），陽性對照組（舒樂安定0.18 mg／（kg·d），酸棗仁湯低、高劑量組（12.96、25.92 g／（kg·d）。各組灌胃給藥2周后，除空白對照組外其余各組用自制改良多平臺法剝奪大鼠睡眠48 h制作老年大鼠REM睡眠剝奪模型。采用免疫組化方法檢測大鼠PVN內(nèi)GABAB1R陽性反應(yīng)物的變化；采用酶聯(lián)免疫法和免疫組織化學法檢測PVN部位環(huán)腺苷酸（cAMP）和磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）水平變化，檢測PVN勻漿液中磷酸二酯酶（PDE）活性的變化。結(jié)果與空白對照組比較，老年REM睡眠剝奪組大鼠PVN部位的GABAB1 R陽性反應(yīng)物數(shù)目明顯增多（P＜0.01），cAMP和p-CREB水平均明顯降低，PDE活性明顯增高（P＜0.01）；與老年REM睡眠剝奪組比較，酸棗仁湯低、高劑量組大鼠PVN部位的GABAB1 R陽性反應(yīng)物數(shù)目明顯減少（P＜0.01），cAMP和p-CREB水平均明顯提高，PDE活性明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論實驗結(jié)果表明，酸棗仁湯可能通過增強GABAB1 R表達來激活cAMP-PKA-CREB信號通路而發(fā)揮安神健腦作用。

老年失眠酸棗仁湯大鼠模型機制

酸棗仁湯出自 《金匱要略》，由酸棗仁、茯苓、知母、川芎、甘草等五味藥組成，諸藥相伍共奏養(yǎng)血安神，清熱除煩之功。臨床主治由肝血不足，陰虛內(nèi)熱引起的虛煩不眠證?，F(xiàn)代研究表明，該方具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗應(yīng)激、改善睡眠時相結(jié)構(gòu)等作用［1-2］。課題前期研究通過促眠實驗以及Morris水迷宮檢測學習記憶實驗，證實了酸棗仁湯的鎮(zhèn)靜催眠及改善學習記憶能力作用［3］，并與腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)［4］。為進一步探索酸棗仁湯改善睡眠質(zhì)量及腦保護的作用機制，本課題擬檢測氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）的B型受體GABAB1R介導(dǎo)下丘腦室旁核（PVN）腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)腺苷酸-蛋白激酶A-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（AC-cAMP-PKA-CREB）學習記憶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的GABAB1R、cAMP和CREB等的表達和變化，探討酸棗仁湯對老年失眠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物自然老年健康24月齡W istar大鼠，雌雄各半，140只，體重500～600 g，由湖北省實驗動物研究中心提前訂購提供，許可證號SCXK（鄂）2008-0005。

1.2 藥物與試劑酸棗仁湯由酸棗仁30 g、知母12 g、茯苓12 g、川芎12 g、甘草6 g組成。全部藥材購自湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥房，常規(guī)方法 （以上方藥加5倍于藥材的溫水，浸泡30 m in后微火煎煮15 min、文火煎20 min，濾出藥渣，分別將藥液濃縮成每毫升含生藥0.648、1.296 g／L藥液）煎煮后經(jīng)水提制成濃度為64.8%、129.6%，分裝滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩７謩e按12.96、25.92 g／（kg·d）劑量（按體表面積系數(shù)換算，分別為人體臨床等效劑量的2倍和4倍）給藥。舒樂安定片，山西亨瑞達制藥有限公司生產(chǎn)，批號111203。戊巴比妥鈉，北京化學試劑公司；多聚甲醛，北京化學試劑公司；3-3二氨基聯(lián)苯胺 （DAB）顯色試劑盒，北京中山生物技術(shù)有限公司；30%H2O2，北京化學試劑公司；0.01M PBS，2000 m L／袋（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；甲醇 （北京化學試劑公司）；正常山羊血清 （工作液，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；5%牛血清白蛋白（BSA，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；GABA_B1抗體（lioworld公司）；GABABR1抗體（lioworld公司）；兔ABC Kit（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；GENMED染色液C、H-E STAINING Kit（GENMED公司，美國）；多克隆PCREB Ser133抗體購于CellSignaling Biotechnology。酶聯(lián)免疫法（EIA）檢測cAMP試劑盒購于Cayman Chemical。cAMP和孔雀石綠購于Sigma。SP免疫組化試劑盒 （含羊抗兔二抗）和DAB顯色劑 （北京中山生物技術(shù)公司）。

1.3 儀器與設(shè)備 睡眠剝奪箱 （自制），為長72 cm、寬48 cm、高30 cm的鼠箱，內(nèi)置6個直徑為8 cm，高8 cm的平臺，平臺間隔16 cm，平臺與鼠箱箱體壁間隔8 cm，在平臺周邊注滿水，水面距平臺面約1.0 cm，大鼠在平臺上可自行飲食飲水，并可在不同平臺上自由活動，于箱體上放平行的不銹鋼絲籠罩，上面放水和食物；環(huán)境對照箱 （自制），與睡眠剝奪箱相似，但在距其底部8.0 cm處不放置平臺，而是放置一面細密鐵絲網(wǎng)，大鼠在網(wǎng)上可自由活動，其他條件均與睡眠剝奪組相同，以形成與睡眠剝奪組相似的環(huán)境；恒溫冷凍切片機（Leica，德國）；顯微鏡（Nikon，日本）。

1.4 動物分組及給藥 將自然老年24月齡W istar大鼠50只（雌雄各半），隨機分成5組，每組10只：空白對照組、老年REM睡眠剝奪組、舒樂安定組 （陽性對照組）、酸棗仁湯低、高劑量組。酸棗仁湯由酸棗仁30 g、知母12 g、茯苓12 g、川芎12 g、甘草6 g組成。舒樂安定組大鼠按0.18 mg／（kg·d）給藥，酸棗仁湯低、高劑量組分別按12.96、25.92 g／（kg·d）給藥，給藥容量均為2 m L／100 g。1次／d，連續(xù)2周。空白對照組、老年REM睡眠剝奪組均灌服等容積生理鹽水。

1.5 老年REM睡眠剝奪大鼠模型的制備及給藥對模型組大鼠采用改良多平臺水環(huán)境法［5］，放置于自制的睡眠剝奪箱進行REM睡眠剝奪48 h?？瞻讓φ战M則放置于環(huán)境對照箱中。

1.6 大鼠腦內(nèi)PVN部位GABAB1R陽性反應(yīng)物谷氨酸受體NMDANR1［6］檢測將大鼠用多聚甲醛灌注，取出大腦，置于4%的多聚甲醛中后固定10 h，然后將腦組織置于30%的蔗糖中4℃保存。組織用冷凍片機切片，放在4℃預(yù)冷的丙酮中后固定，采用ABC法染色。拍攝圖像在顯微鏡物鏡40倍和數(shù)碼相機4倍，光學放大下進行照像。每組隨機測試6張切片，每一部位隨機測試2個視野；分別測量陽性細胞數(shù)目。

1.7 大鼠腦內(nèi)PVN部位cAMP-PKA-CREB信號通路［7］檢測方法

1.7.1 酶聯(lián)免疫分析法（EIA法）檢測cAMP給藥結(jié)束后，斷頭處死動物，冰上取出下丘腦組織，稱重后于質(zhì)量分數(shù)為5%的TCA緩沖液中勻漿。勻漿液4℃下1 500 g離心10 min，收集上清儲存在-70℃冰箱待測。加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μL，余孔分別加標準品或待測樣品100μL，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120 min。棄去液體，甩干，不洗。每孔加檢測溶液A工作液100μL（使用前1 h內(nèi)配制），酶標板加上覆膜37℃反應(yīng)60 min。溫育60 min，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，大約400μL／每孔，甩干。每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）100μL，酶標板加上覆膜37℃反應(yīng)60 min。溫育60 min后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，350μL／每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜37℃避光顯色。依序每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

1.7.2 免疫組織化學法檢測CREB給藥結(jié)束后進行麻醉后，灌流固定，取腦切片，切制含PVN部位的間腦連續(xù)冠狀切片 （厚度4μm）。切片常規(guī)脫蠟至水。92℃枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）中抗原熱修復(fù)10 min，室溫冷卻30 m in。質(zhì)量分數(shù)為3%雙氧水室溫作用10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，非特異性位點用羊血清室溫封閉15 m in。加一抗P-CREB抗體稀釋液4℃過夜。滴加羊抗兔二抗37℃孵育15 min，滴加SP復(fù)合物37℃孵育15 min。DAB顯色，雙蒸水終止反應(yīng)。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。觀察高倍鏡下胞內(nèi)有棕色顆粒者為表達CREB的陽性細胞。計數(shù)每組各5只動物PVN部位CREB陽性細胞數(shù)目。

1.7.3 酶活性檢測方法檢測磷酸二酯酶（PDE）活性標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μL，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μL，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μL分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μL，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μL棄掉，再各取50μL分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50μL，混勻；混勻后從第5、6孔中各取50μL分別加到第7、8孔中，再在第7、8孔中分別加標準品稀釋液50 μL，混勻后從第7、8孔中分別取50μL加到第9、10孔中，再在第9、10孔分別加標準品稀釋液50μL，混勻后各出50μL棄掉（稀釋后各孔加樣量都為50μL，濃度分別為300 nmol／L、200 nmol／L、100 nmol／L、50 nmol／L、25 nmol／L）。分別設(shè)空白孔 （空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10μL。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30 min，稀釋后備用。棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。除空白孔外，每孔加入酶標試劑50μL。溫育操作同3。洗滌操作同5。每孔先加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B50μL，37℃避光顯色15 min。每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)。以空白空調(diào)零，450 nm波長測量各孔的吸光度 （OD值）。

2 結(jié)果

2.1 酸棗仁湯對老年REM睡眠剝奪大鼠腦內(nèi)PVN部位GABAB1R陽性反應(yīng)物的影響與空白對照組比較，老年REM睡眠剝奪組大鼠大腦PVN部位的GABAB1R陽性反應(yīng)物數(shù)量明顯增多（P＜0.01）；與老年REM睡眠剝奪組比較，酸棗仁湯低、高劑量組大鼠大腦PVN部位的GABAB1R陽性反應(yīng)物數(shù)量明顯減少（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠腦內(nèi)PVN部位GABAB1R陽性反應(yīng)物的影響比較 （±s）

表1 各組大鼠腦內(nèi)PVN部位GABAB1R陽性反應(yīng)物的影響比較 （±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與老年REM睡眠剝奪組比較，bP＜0.01

組別 劑量（g／kg）只數(shù) GABABR1空白對照組 等容10 86±13老年REM睡眠剝奪組 等容 10 126±15a舒樂安定組 0.18×10-3 10 104±12b酸棗仁湯低劑量組 12.96 10 98±11b酸棗仁湯高劑量組 25.92 10 94±9b

2.2 各組大鼠腦內(nèi)PVN部位cAMP-PKACREB信號通路指標比較與空白對照組比較，老年REM睡眠剝奪組大鼠大腦PVN部位cAMP和p-CREB水平均明顯降低，PDE活性明顯增高（P＜0.01）；與老年REM睡眠剝奪組比較，酸棗仁湯低、高劑量組大鼠大腦PVN部位cAMP和p-CREB水平均明顯提高，PDE活性明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠腦內(nèi)PVN部位cAMP-PKA-CREB信號通路中的

3 討論

前期實驗采用D-半乳糖復(fù)制亞急性衰老大鼠模型，雖然自由基水平接近自然衰老大鼠，但是由于該衰老模型是由化學損傷造成的，難以真實反映衰老的生理生化改變，因此本課題改進造模方法而選用自然老年24月齡W istar大鼠，采用國際上公認的多平臺水環(huán)境法剝奪睡眠48 h，建立老年大鼠睡眠剝奪模型。下丘腦室旁核 （PVN）是人體神經(jīng)內(nèi)分泌及自主神經(jīng)系統(tǒng)的重要整合中樞核團，它參與各種應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。γ-氨基丁酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其對學習記憶的影響主要是通過其受體來介導(dǎo)完成。GABA受體主要有GABAA、GABAB兩種類型受體，其中GABA B受體是G -蛋白偶聯(lián)受體［8］。GABA B受體根據(jù)解剖定位及生理功能的差異可分為突觸前受體和突觸后受［9］。突觸前GABA B受體又分為異身受體和自身受體［10］，其異身受體可能降低興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸 （Glu）釋放，介導(dǎo)突觸前抑制［11］，而其自身受體則可降低抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的釋放，介導(dǎo)突觸前去抑制，解除GABA產(chǎn)生的突觸前抑制所造成的Mg2+對谷氨酸受體NMDA受體離子通道的阻抑作用，有利于去極化［12］。突觸后的GABA B受體可以通過G蛋白而激活K+通道，也可通過第二信使 （如花生四烯酸AA）途徑而激活K+通道引起K+大量內(nèi)流產(chǎn)生突觸后膜超極化［13］。GABAB1R是GABABR受體的主要部分。研究表明，在PVN內(nèi)有表達GABAB1R的神經(jīng)元［14］，本實驗通過觀察老年失眠大鼠的GABAB1R變化，探討其對學習記憶能力的改變具有重要的意義。另外，前期實驗研究結(jié)果表明，睡眠剝奪可造成記憶力減退，酸棗仁湯可發(fā)揮腦保護作用而改善學習記憶能力［7］?？梢奀REB作為cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白對于認知功能至關(guān)重要。實驗結(jié)果顯示，GABABR作為G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRS），酸棗仁湯能增加其在大腦下丘腦部位的表達，可明顯提高大腦下丘腦PVN部位cAMP和p-CREB水平，降低PDE活性明顯降低，能激活cAMP-PKA-CREB信號通路發(fā)揮安神健腦作用。提示酸棗仁湯可能通過增強GABAB1 R表達來介導(dǎo)并激活cAMP-PKACREB信號通路而發(fā)揮安神健腦作用。該研究為酸棗仁湯的臨床應(yīng)用提供了理論支持，有望為老年失眠的防治開辟新的思路。

［1］ 李玉娟，劉雯，楊靜玉，等.酸棗仁湯的鎮(zhèn)靜催眠作用［J］.沈陽藥科大學學報，2002，19（2）：l15-l16.

［2］ 金陽，李飛，李廷利.酸棗仁湯對失眠大鼠睡眠時相的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19（6）：1355-1356.

［3］ 游秋云，王平，吳麗麗，等.酸棗仁湯對老年失眠證候模型大鼠學習記憶及腦內(nèi)自由基、NOS的影響［J］.中華行為醫(yī)學與腦科學雜志，2010，19（10）：885-887.

［4］ 游秋云，王平，孔明望，等.酸棗仁湯對老年失眠證候模型大鼠腦組織谷氨酸、γ-氨基丁酸及γ-氨基丁酸A受體表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（14）：119-123.

［5］ 崔開宇，王平，游秋云.益智仁揮發(fā)油對大鼠快動眼睡眠剝奪恢復(fù)后腦組織氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量及其受體表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（4）：223-227.

［6］ 劉燕，劉曉蘭，宋月晗，等.四逆散對疲勞大鼠學習記憶及腦內(nèi)GABA_B1表達的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2011，11（1）：5-7.

［7］ 王玉珠，王永勝，楚世峰，等.人參皂苷Rgl促智信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究［J］.中國藥理學通報，2008，24（6）：740-743.

［8］Bormann J.The“ABC”of GABA receptors［J］.Trends Pharmacol Sci，2000，21：16-19.

［9］LingridgeGL，RandallAD.The synaptic activition of NMDA and Ca2+signaling in neurons［J］.Ciba Eound Syrup，1992，164：162-171.

［10］Nelson MT，ConmayMA，KnotHJ.Cloride channel blockers inhibitmyogenic tone in rat cerebral artcries［J］.JPhysiol，1997，502：259-264.

［11］BonannoG，F(xiàn)assioA，Schm id G，el al.Pharmacologi-cally dlstinstGABAa recap to rs that mediate inhibition of GABA and glutamate release in human neocortex［J］.Br JPharmacol，1997，120（1）：60-64.

［12］CollingridgeGL，RandallAD.Thesynaptieactivition of NMDA and Ca2+signalling in neurons［J］.Ciba Found Symp，1992，164：162-171.

［13］M isgeld U，Bijak M，Jarolimek W.A 1physiological role for GABAB receptors and the effects of baclofen in the mammalian central nervous system［J］.Prog Neurobi0I，1995，46：423-446.

［14］Li D，PanH.Role ofγ-Am inobutyric Acid（GABA）A and GABAB receptors in paraventricular nucleus in control of sympathetic vasomotor tone in hypertension［J］.JPharmacolExp Ther，2007，320：615-626.

Effects of Suanzaoren Decoction on cAM P-PKA-CREB Signaling Pathway in Hypothalamic Paraven tricular Nuclear（PVN）Mediated by GABAB1R in Agedrat with REM Sleep Deprivation

You Qiuyun，Wang Ping*，Zhang Shunbo，Huang Panpan，Zhang Chengpeng.*Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China

WangPing，Key Laboratory of Dementia on Xinnao-Yizhi，the National Chinese Medicine Administrative Bureau.E-mail：pwang54＠aliyun.com

ObjectiveObserve the effect of Suanzao-Rentang on cAMP-PKA-CREB signaling pathway in hypothalam ic paraventricular nuclear（PVN）ofaged ratwhose rapid eyemovement sleep has been deprived.MethodsNatural age24 month-old Wistar rats arerandom ly divided into control group（isovolumetric saline），REM sleep deprivation elderly group（isovolumetric saline），positive control group（estazolam 0.18 mg／（kg·d），Suanzao-Rentang low and high dose group（12.96，25.92 g／（kg·d）.Each group isgiven intragastric administration for two weeks.A fter that，except for the control group，each group ismade REM sleep deprivation 48hours production model of old rats with homemade improved multi-platform.Then，we use Immunohistochem istry for detecting changes of GABAB1R positive reactant in the rat PVN，enzyme-linked immunosorbent assay and immunohistochem istry for detecting changes of cyclic adenosinemonophosphate（cAMP）in part of PVN and cAMP response element binding protein（CREB）levels，aswell as activity of homogenate phosphodiesterase（PDE）in PVN.ResultsCompared with the control group，the amount of positive reaction GABAB1 R in PVN sitessignificantly increases（P＜0.01），cAMP and p-CREB levels significantly reduce，PDE activity significantly increases（P＜0.01）in the REM sleep deprivation oldrats；compared with the older group in which the rates’REM sleep hasbeen deprived，the positive reaction amountof GABAB1 R in PVN significantly reduces（P＜0.01），cAMPbutp-CREB levels significantly increases，PDE activity significantly reduces（P＜0.01）in Suanzao-Rentang low and high-dose group of rats.ConclusionThe results show that Suanzao-Rentang possibly play a role in brain nerves by enhancing GABAB1 R expression whichactivates cAMP-PKA-CREB signaling pathway.

elderly insomnia；SZRT；model rats；mechanism

國家自然科學基金（編號：81072849）

430065武漢，湖北中醫(yī)藥大學藥學院（游秋云）；國家中醫(yī)藥管理局老年性癡呆醒腦益智重點研究室（王平、張舜波、黃攀攀、章程鵬）

王平，E-mail：pwang54＠aliyun.com