周婷婷，易敏英，相大鵬，李 理*

（1.華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州 510623）

豆腐乳被譽(yù)為是中國(guó)的大豆奶酪，是豆腐經(jīng)毛霉發(fā)酵、鹽腌后熟而制成的一種食品，可佐餐，亦可調(diào)味。中國(guó)是腐乳的發(fā)源地，各地腐乳具有不同的風(fēng)味特色[1]，受到消費(fèi)者的歡迎。由于腐乳是敞開(kāi)式發(fā)酵，且大多為傳統(tǒng)的手工操作，因此很容易受到各種環(huán)境微生物的污染[2-3]，從而影響產(chǎn)品的品質(zhì)，甚至對(duì)消費(fèi)者的安全帶來(lái)隱患。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種條件致病菌，通常當(dāng)其在食物中的含量超過(guò)105CFU/g（mL）時(shí)就有可能帶來(lái)中毒癥狀。患者感染了蠟樣芽孢桿菌，通常會(huì)產(chǎn)生嘔吐、腹瀉等癥狀，同時(shí)伴有頭暈、惡心、發(fā)熱，腸毒素和嘔吐毒素是引起上述癥狀的主要原因。該菌抗逆性強(qiáng)在環(huán)境中分布極為廣泛，是腐乳生產(chǎn)中常見(jiàn)的污染菌[4-5]。該實(shí)驗(yàn)研究了白腐乳中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況，并進(jìn)一步分析了某品牌腐乳生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的污染狀況，為腐乳生產(chǎn)的安全性改善提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白腐乳樣品：市售；生產(chǎn)環(huán)節(jié)的半成品（包括生豆?jié){、熟豆?jié){、黃漿水、酸漿水、豆腐、種水、毛坯、鹽坯、鹽水及后熟等樣品）：某品牌生產(chǎn)廠家；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、平板計(jì)數(shù)瓊脂、甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂培養(yǎng)基（mannitol yolk polymyxin agar base，MYP）（一次性成品培養(yǎng)基）、血平板培養(yǎng)基（一次性成品培養(yǎng)基）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；API 50 CHB/E 培養(yǎng)基：法國(guó)生物梅里埃公司；AgNO3：天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ500電子天平：浙江余姚紀(jì)銘稱(chēng)重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；YXQ-SG46-280S手提式高溫滅菌鍋：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-ID單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HSG-IB-2電熱恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；DensiCHEKPlus數(shù)字顯示電子比濁儀：法國(guó)生物梅里埃公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌落總數(shù)的檢測(cè)方法[6]

在無(wú)菌操作室內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行處理，用研缽將樣品充分的研磨，稱(chēng)取25g（量取25mL）處理好的待測(cè)樣品于225mL、8.5%的無(wú)菌生理鹽水中進(jìn)行稀釋。選擇3個(gè)合適稀釋度的菌懸液，吸入1mL菌懸液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)菌懸液測(cè)兩個(gè)平行，然后向每個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中傾注15～20mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（約46℃）并混勻。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（48±2）h后計(jì)數(shù)。每克或每毫升樣品中所含的菌落總數(shù)的計(jì)算公式如下：

式中：N為樣品菌落總數(shù)，CFU/g；∑C為適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)平板菌落數(shù)之和；n1和n2分別為第一個(gè)和第二個(gè)適宜稀釋度平板數(shù)；d為稀釋因子。

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌總數(shù)的檢測(cè)方法[7]

樣品處理及稀釋同1.3.1，選取3個(gè)合適的稀釋度，分別吸取0.1mL菌懸液于MYP選擇性培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度測(cè)2個(gè)平行，用L型涂布棒均勻涂布，37℃培養(yǎng)（12～20）h后計(jì)數(shù)。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，蠟樣芽孢桿菌在MYP平板上的典型菌落為粉紅色（表示不發(fā)酵甘露醇），周?chē)蟹奂t色的暈（表示產(chǎn)生卵磷脂酶）。挑取5個(gè)可疑的蠟樣芽孢桿菌菌落進(jìn)行生化鑒定分析。若經(jīng)生化鑒定檢測(cè)出其中A個(gè)菌落為蠟樣芽孢桿菌，此稀釋度共有B個(gè)可疑的蠟樣芽孢桿菌菌落，則每克或每毫升樣品所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)計(jì)算公式如下：

式中：X為樣品蠟樣芽孢桿菌數(shù)，CFU/g；A為挑取的5個(gè)疑似蠟樣芽孢桿菌菌落中，經(jīng)生化鑒定分析確信為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)；B為該稀釋度下可疑蠟樣芽孢桿菌的總數(shù)；10為吸取0.1mL菌懸液進(jìn)行涂布的稀釋倍數(shù)。

1.3.3 蠟樣芽孢桿菌的生化鑒定[8]

試驗(yàn)采用API 50 CHB/E試劑盒對(duì)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行生化鑒定。該試劑盒是一種快速檢測(cè)培養(yǎng)基，它含有50種發(fā)酵作用的糖API 50CH試驗(yàn)條。首先將需要鑒定的蠟樣芽孢桿菌可疑菌落分離純化，并在血平板培養(yǎng)基上面富集培養(yǎng)，刮下菌胎于特殊培養(yǎng)液制成濁度≥2.0麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，接種于試劑條的每一個(gè)管，在30℃條件下培養(yǎng)24h后閱讀試劑條。由于糖發(fā)酵產(chǎn)酸，使試劑條變色，然后以陰性（－）、陽(yáng)性（＋）、可疑（?）記錄每一個(gè)試驗(yàn)結(jié)果，將結(jié)果記錄在結(jié)果判讀單上。繼續(xù)培養(yǎng)24h，再次記錄每個(gè)生化反應(yīng)的結(jié)果。將兩次判讀的結(jié)果都輸入ApiLab軟件（生物梅里埃，法國(guó)）進(jìn)行鑒定分型。

1.3.4 氯化鈉含量的測(cè)定方法[9]

取適量待測(cè)樣品于研缽中研磨，轉(zhuǎn)8g研磨好的樣品于小燒杯中，加少量60℃的溫水溶解攪拌，并于電爐上加熱煮沸，一邊攪拌一邊冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中定容，混勻，測(cè)定鹽含量前可用濾紙進(jìn)行過(guò)濾。

配制0.100mol/L的硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)液，以絡(luò)酸鉀作為指示劑。吸取2.0mL樣品液于錐形瓶中，加入50mL蒸餾水及2滴絡(luò)酸鉀指示劑，搖勻，用硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)液滴定至剛剛出現(xiàn)磚紅色，同時(shí)做空白對(duì)照，食鹽含量的計(jì)算公式如下：

式中：X為食鹽含量，g/100g；V1為測(cè)試樣品時(shí)消耗硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V2為空白對(duì)照所消耗的硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；C為硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度，mol/L；m為稱(chēng)取樣品的質(zhì)量，g；0.058 5為1.00mL硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)液的濃度相當(dāng)于氯化鈉的質(zhì)量，g。

1.3.5 水分含量的測(cè)定方法[1]

取一塊腐乳，放在漏斗上10min左右濾去鹵湯，在研缽中充分研磨，稱(chēng)取研磨好的樣品5g左右，在烘干至質(zhì)量恒定的稱(chēng)量瓶中平鋪，加蓋，精密稱(chēng)量。置于105℃烘箱內(nèi)，干燥4h，加蓋置于干燥器中冷卻0.5h后稱(chēng)量，然后再干燥1h，冷卻0.5h后再稱(chēng)量，直到兩次稱(chēng)量差＜2mg即為恒質(zhì)量，水分含量的計(jì)算公式如下：

式中：m1為稱(chēng)量瓶和樣品的質(zhì)量，g；m2為稱(chēng)量瓶和樣品干燥后的質(zhì)量，g；m3為稱(chēng)量瓶的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐乳細(xì)菌總數(shù)及蠟樣芽孢桿菌數(shù)分析

白腐乳樣品菌落總數(shù)及蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 白腐乳中細(xì)菌總數(shù)、蠟樣芽孢桿菌數(shù)及鹽含量、水分含量的分析Table 1 Analysis of total bacterial count, Bacillus cereus count,salt content and water content in sufu

由表1可知，所檢測(cè)的白腐乳樣品菌落總數(shù)在102～106CFU/g。菌落總數(shù)較高主要是腐乳的生產(chǎn)至今仍然遵循傳統(tǒng)手工生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)模式較為粗放，生產(chǎn)車(chē)間密封性差，操作人員衛(wèi)生管理不嚴(yán)格等原因?qū)е碌腫10]。在抽檢的10個(gè)白腐乳樣品中，有7個(gè)樣品檢出了蠟樣芽孢桿菌，檢出率為70%，其中有2個(gè)樣品的蠟樣芽孢桿菌數(shù)達(dá)到106CFU/g。我國(guó)并沒(méi)有現(xiàn)行的對(duì)腐乳中蠟樣芽孢桿菌含量限制的標(biāo)準(zhǔn)，所以，通常采用腐乳出口其他國(guó)家時(shí)，其他國(guó)家地區(qū)對(duì)蠟樣芽孢桿菌的限量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)規(guī)范。例如香港，就按照即食食品微生物含量指引規(guī)定，當(dāng)蠟樣芽孢桿菌≥105CFU/g為不可接受[11]。以出口香港蠟樣芽孢桿菌限量為標(biāo)準(zhǔn)，此次對(duì)腐乳的檢測(cè)結(jié)果顯示蠟樣芽孢桿菌超標(biāo)率為30%。

由表1還可以得出，腐乳中的食鹽含量基本在6～11g/100g，腐乳中的蠟樣芽孢桿菌數(shù)并未隨著食鹽含量的變化產(chǎn)生明顯的規(guī)律性，這說(shuō)明食鹽含量對(duì)腐乳中蠟樣芽孢桿菌的抑制還受其他因素的影響。水分含量也在一定程度上影響白腐乳中蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)，水分含量低的樣品蠟樣芽孢桿菌數(shù)也較低，其中一些以油為湯汁的腐乳樣品中蠟樣芽孢含量較低，甚至未檢出，說(shuō)明降低水分含量及油脂可以有效控制腐乳樣品中蠟樣芽孢含量。

2.2 白腐乳中間產(chǎn)品的細(xì)菌總數(shù)及蠟樣芽孢桿菌數(shù)分析

2.2.1 白腐乳前期發(fā)酵中間產(chǎn)品的細(xì)菌總數(shù)及蠟樣芽孢桿菌數(shù)分析

為了探明腐乳中蠟樣芽孢桿菌的污染途徑，本研究從某品牌生產(chǎn)廠家現(xiàn)場(chǎng)采集不同階段的中間產(chǎn)品共9個(gè)樣品，并重復(fù)3次，檢測(cè)其細(xì)菌總數(shù)及蠟樣芽孢桿菌數(shù)，以期在源頭上控制其數(shù)量，其中間產(chǎn)品的細(xì)菌總數(shù)分析結(jié)果見(jiàn)表2，蠟樣芽孢桿菌數(shù)分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 腐乳中間產(chǎn)品的細(xì)菌總數(shù)分析Table 2 Total bacterial count in the semi-finished products of sufu

由表2可知，在腐乳的整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中，菌落總數(shù)一直處于較高的水平，3批樣品的菌落總數(shù)平行度很高。在生豆?jié){中檢出的菌落總數(shù)就已達(dá)到108CFU/mL，煮漿后菌落總數(shù)降到106CFU/mL，說(shuō)明加熱能夠殺死部分不耐熱的細(xì)菌；不過(guò)，在豆腐的點(diǎn)鹵過(guò)程中，酸漿水又引入了部分雜菌，使得豆腐坯中細(xì)菌數(shù)又有所升高，達(dá)到105CFU/g，說(shuō)明酸漿水是引入細(xì)菌的重要環(huán)節(jié)。通過(guò)接種、培菌，毛坯中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)一步增加，達(dá)到109CFU/g；經(jīng)過(guò)后續(xù)的搓毛和鹽腌步驟，細(xì)菌數(shù)僅有小幅度下降；最后，浸泡豆腐所用到的鹽水中也有很高的細(xì)菌數(shù)，這主要是因?yàn)?，浸泡鹽坯所使用的鹽水為多次重復(fù)利用，即將上一批浸泡過(guò)腐乳的鹽水回收重新灌裝到下一批鹽坯，所以如果上一批樣品污染了雜菌則會(huì)將細(xì)菌帶入后一批的腐乳產(chǎn)品中[12]。

表3 腐乳中間產(chǎn)品的蠟樣芽孢桿菌數(shù)分析Table 3 Bacillus cereus count in semi-finished products of sufu

由表3可知，3批樣品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)的平行度較高。在3批生豆?jié){中都未檢測(cè)出蠟樣芽孢桿菌，但在后兩批樣品的熟豆?jié){中就已檢測(cè)出蠟樣芽孢桿菌，不過(guò)含量并不高，這說(shuō)明蠟樣芽孢桿菌可能來(lái)自于設(shè)備的管道污染。表3結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌污染腐乳的主要中間產(chǎn)品為酸漿水、種水和鹽水。通過(guò)對(duì)生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，黃漿水為敞開(kāi)式自然發(fā)酵，因此易被環(huán)境污染。此外，由于使用傳統(tǒng)工藝及鹽水的循環(huán)利用，使得種水和鹽水中蠟樣芽孢桿菌處于較高的水平。當(dāng)使用這樣的酸漿水來(lái)凝乳時(shí)，所獲得的豆腐乳也就含有蠟樣芽孢桿菌，再通過(guò)接種和培菌，毛坯中的蠟樣芽孢桿菌可以增殖定到一個(gè)很高的水平。由此可見(jiàn)，要想控制最終產(chǎn)品中的蠟樣芽孢桿菌數(shù)量，必須從酸漿水、種水和鹽水幾個(gè)環(huán)節(jié)著手。

2.2.2 腐乳后期發(fā)酵中產(chǎn)品的細(xì)菌總數(shù)及蠟樣芽孢桿菌數(shù)分析

表4 腐乳后發(fā)酵階段菌落總數(shù)和蠟樣芽孢數(shù)檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of total bacterial count and Bacillus cereus in the secondary fermentation

由表4可知，經(jīng)過(guò)45d的后期發(fā)酵，腐乳中的菌落總數(shù)以及蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量均呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)楦辂}坯中鹽含量很高，在浸入鹵湯后一段時(shí)間達(dá)到瓶?jī)?nèi)鹽含量平衡，較高的鹽含量能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。不過(guò)值得注意的是，細(xì)菌總數(shù)還是蠟樣芽孢桿菌數(shù)的下降空間都是有限的，僅僅是1～2個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。經(jīng)過(guò)后期發(fā)酵，起始蠟樣芽孢總數(shù)為105CFU/g的產(chǎn)品在出廠前降至103CFU/g，在安全限量以下，所以在前期生產(chǎn)結(jié)束后鹽坯中蠟樣芽孢桿菌應(yīng)盡可能控制在≤105CFU/g。

2.2.3 腐乳生產(chǎn)中蠟樣芽孢桿菌的控制措施

由上述檢測(cè)結(jié)果可以得出，腐乳生產(chǎn)過(guò)程中蠟樣芽孢桿菌的污染環(huán)節(jié)主要是酸漿水的發(fā)酵、豆腐的壓制、種水的噴灑以及鹽水浸泡過(guò)程。所以，有必要在前期生產(chǎn)過(guò)程中將蠟樣芽孢桿菌降低到最低范圍以保證后期發(fā)酵時(shí)蠟樣芽孢桿菌處于安全水平，針對(duì)這幾個(gè)關(guān)鍵的污染環(huán)節(jié)，提出以下幾點(diǎn)針對(duì)性的控制措施。

首先，加強(qiáng)生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的監(jiān)測(cè)，酸漿水、種水和鹽水的蠟樣芽孢桿菌水平要重點(diǎn)監(jiān)控，一旦發(fā)現(xiàn)升高的跡象即迅速采取措施控制。由于生產(chǎn)中將黃漿水敞開(kāi)放置隔夜，第二天發(fā)酵成酸漿水，酸漿水通過(guò)貼近地面的半封閉式管道流入下一生產(chǎn)步驟，用于點(diǎn)豆腐。但由于黃漿水營(yíng)養(yǎng)豐富，易于變質(zhì)，敞開(kāi)放置隔夜后可能會(huì)有大量的有害微生物滋長(zhǎng)；發(fā)酵形成酸漿水后，酸漿水貼近地面流動(dòng)，很容易將土壤和空氣中的蠟樣芽孢桿菌帶入產(chǎn)品引起污染。所以應(yīng)該采用密封容器盛放黃漿水，酸漿水應(yīng)在封閉的管道內(nèi)流動(dòng)以避免細(xì)菌落入，除此之外，由于黃漿水要放置隔夜，還要對(duì)黃漿水進(jìn)行滅菌，但因?yàn)辄S漿水中還含有凝固豆腐所需的乳酸菌和酵母菌，不能采取加熱煮沸的方式來(lái)殺菌，可選取一些選擇性強(qiáng)的天然抑菌劑，針對(duì)性地減少或殺滅酸漿水中的蠟樣芽孢桿菌。種水和鹽水現(xiàn)配先用，爭(zhēng)取將蠟樣芽孢桿菌抑制至最低水平。

其次，選擇有效的消毒方法。目前，在所有的消毒滅菌的方法中，應(yīng)用得最廣泛的是熱力滅菌，但由于蠟樣芽孢桿菌含有內(nèi)生孢子，耐熱性強(qiáng)，用傳統(tǒng)的加熱煮沸方式不能達(dá)到良好的效果。如果使用具有光滑表面的設(shè)備，則應(yīng)用洗滌劑清潔、流水沖洗可能更有效。當(dāng)然，最有效的辦法是篩選到針對(duì)蠟樣芽孢桿菌的殺菌劑，如有報(bào)道表明過(guò)氧乙酸和二氧化氯對(duì)蠟樣芽孢桿菌有很好的殺滅效果[13]。此外，一些天然的香辛料提取物如大蒜精油也具有殺滅、抑制蠟樣芽孢桿菌的作用[14]。

第三，加強(qiáng)菌種管理。雖然采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵可以制備出風(fēng)味獨(dú)特穩(wěn)定的腐乳產(chǎn)品，但仍需要在風(fēng)味和安全性方面取得平衡，對(duì)菌種進(jìn)行分離、純化及妥善保藏都是有必要的[15]。

3 結(jié)論

檢測(cè)白腐乳及其生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)中樣品的菌落總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌數(shù)。結(jié)果表明，白腐乳中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為70%，其中30%的樣品超出港標(biāo)的要求。分析了腐乳中蠟樣芽孢桿菌的主要污染來(lái)源和污染途徑。在腐乳的生產(chǎn)過(guò)程中，蠟樣芽孢桿菌主要通過(guò)酸漿水、種水、鹽水污染產(chǎn)品，需在生產(chǎn)中加以控制。通過(guò)檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌在腐乳后發(fā)酵階段的變化情況，發(fā)現(xiàn)成品腐乳的菌落總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌數(shù)有一定的下降，后發(fā)酵開(kāi)始之前蠟樣芽孢桿菌數(shù)為105CFU/g的產(chǎn)品在后發(fā)酵結(jié)束降至103CFU/g，說(shuō)明如果將前期產(chǎn)品中的蠟樣芽孢桿菌控制在一定范圍內(nèi)，經(jīng)過(guò)后發(fā)酵過(guò)程，腐乳中的蠟樣芽孢桿菌即可達(dá)到出口香港要求。根據(jù)對(duì)蠟樣芽孢桿菌在腐乳生產(chǎn)過(guò)程中的污染情況調(diào)查，建議從加強(qiáng)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)、加強(qiáng)菌種管理及選擇有效消毒方法等方面降低產(chǎn)品中的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。

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