權(quán)淑靜，解復(fù)紅，馬 煥，劉德海 *，陳國參

（1.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450008；2.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008）

α-淀粉酶是一種催化淀粉內(nèi)部α-1，4-糖苷鍵水解，釋放出葡萄糖及不同長度直鏈或支鏈低聚糖的胞外酶。該酶廣泛應(yīng)用于淀粉深加工、釀酒、酒精生產(chǎn)、食品、紡織、飼料及醫(yī)藥等行業(yè)。按照酶的活性、最適pH可分為酸性、堿性和中性α-淀粉酶3種，大多數(shù)α-淀粉酶為中性[1]，在酸性條件下酶活明顯降低，已不能滿足一些酸性條件下淀粉原料的深加工工藝的要求。

隨著商業(yè)需求的增加，通過α-淀粉酶生產(chǎn)高質(zhì)量麥芽糖的需求也在不斷增加[2]，目前用于淀粉加工的淀粉酶最適pH值為6.8，液化過程需要將淀粉漿從其原有的pH值為3.2～4.5提高至5.8～6.2，此外，添加Ca2+以提高酶的活性和穩(wěn)定性。接下來的糖化步驟需要調(diào)整pH值至4.2～4.5。這些步驟耗費(fèi)時間和成本。因此，需要適應(yīng)極端酸性環(huán)境的高活性淀粉酶產(chǎn)品[3-4]。

近年來，國內(nèi)外對耐酸性α-淀粉酶進(jìn)行了廣泛的研究，并相繼發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌、真菌、酵母菌可產(chǎn)生耐酸性α-淀粉酶，最適pH大多在4.0～6.0。我國開展相關(guān)研究起步較晚，目前主要集中在菌種選育和構(gòu)建基因工程菌等方面，所選菌株的產(chǎn)酶活力不高且缺乏可靠的安全性。為了滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要，本實(shí)驗從酒曲中篩選一株產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的菌株，并對酶的組成成分和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為工業(yè)化應(yīng)用提供重要的基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

河南省王勿橋醋業(yè)有限公司釀造用磚曲。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，1%鏈霉素3mL/L。

平板分離培養(yǎng)基：KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，瓊脂18.0g/L，pH5.0，1%孟加拉紅水溶液3.3mL/L。臨用時每100mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉40.0g/L，尿素2.0g/L，蛋白胨2.0g/L，KH2PO43.0g/L，CaCl20.1g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，pH5.0。

斜面保藏采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂18g/L。

1.1.3 試劑

2×TaqPCR MasterMix：天根生化科技（北京）有限公司；通用引物NS1、NS8：深圳華大基因科技有限公司；Trans2K plus：北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖：北京恒奧生物科技有限公司；蛋白胨：英國OXOID公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Multifuge X1R離心機(jī)：德國Thermo公司；Phenom proX臺式掃描電鏡：美國FEI公司；T6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶真菌菌株的篩選

平板分離：將磚曲在30W紫外燈下照射30min表面消毒，用無菌刀在內(nèi)部多點(diǎn)取樣并混勻。取1g粉末于富集培養(yǎng)基中，30℃、180r/min富集培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)液分別稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6五個不同梯度與平板分離培養(yǎng)基混合倒平板，30℃恒溫培養(yǎng)3～5d，挑取單菌落保藏至斜面。

菌株篩選：將分離到的菌株接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180r/min培養(yǎng)3d后測酶活。將酶活最高的菌株作為進(jìn)一步研究的出發(fā)菌株。

粗酶液的制備：將發(fā)酵液經(jīng)4層滅菌紗布過濾后，8 000r/min離心10min，取上清液。

酶活測定方法參照文獻(xiàn)[5]：180μL底物加入20μL酶液，對照（CK）為20μL緩沖液，在一定溫度條件下反應(yīng)10min，加入200μL 3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑，沸水浴5min終止反應(yīng)，冷卻后加蒸餾水2.1mL，在波長520nm條件下測定吸光度值。

酶活力定義：70℃、pH 3.6條件下每分鐘從1%可溶性淀粉中釋放1μmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位（U）。

相對酶活的測定：相對酶活是以同組實(shí)驗中活性最高點(diǎn)的值為100%，其余實(shí)驗點(diǎn)的值與該點(diǎn)的值之比，通常以百分?jǐn)?shù)表示。

1.3.2 菌株的鑒定

（1）形態(tài)觀察[6]。

將分離純化的菌株點(diǎn)種在PDA固體培養(yǎng)基平板上30℃培養(yǎng)48h，觀察其菌絲生長情況，菌落形態(tài)、邊緣、菌絲長度和顏色（正面、反面）；直接制片觀察法觀察孢子、菌絲形態(tài)。

（2）分子生物學(xué)鑒定

真菌DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法[7]。

菌株18S rDNA：PCR擴(kuò)增采用引物為：NS1（5′-GTA GTCATATGCTTGTCTC -3′）；NS8（5′-TCCGCAGGTTC ACCTACGGA-3′）。

PCR擴(kuò)增體系為50μL，包括無菌雙蒸水19μL，正向和反向引物各2.0μL，模板DNA 2.0μL，2×TaqPCR MasterMix 25μL。

反應(yīng)體系：每個反應(yīng)30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸10min，首次循環(huán)在95℃預(yù)變性2min。

將聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送華大基因測序。通過GenBank數(shù)據(jù)做相似性分析。

1.3.3 粗酶液酶學(xué)性質(zhì)初步研究

酶反應(yīng)最適溫度：將離心后的粗酶液稀釋一定倍數(shù)，與底物在不同溫度下進(jìn)行反應(yīng)，溫度梯度設(shè)置為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，測定酶活，確定最適溫度。

酶反應(yīng)溫度穩(wěn)定性：將稀釋適當(dāng)倍數(shù)的粗酶液分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃保溫1h，最適溫度條件下測定剩余酶活。

酶反應(yīng)最適pH：用pH分別為3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0的緩沖液配制底物1%淀粉溶液，用相應(yīng)pH的緩沖液測定酶活（NaH2PO4-檸檬酸緩沖體系）。

酶反應(yīng)pH穩(wěn)定性：將酶液用相應(yīng)pH的緩沖液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，在50℃保溫1h，70℃測定剩余酶活。

金屬離子對酶活力的影響：在反應(yīng)體系中分別加入2mmol/L的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、K+、Co2+，測定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸性α-淀粉酶淀粉酶菌株篩選

經(jīng)過篩選獲得了6株酶活較高的產(chǎn)α-淀粉酶菌株，粗酶液的酶活見表1。由表1可以看出，A-5-3的酶活最高，達(dá)到282.38U/mL，因此確定A-5-3為出發(fā)菌株。

表1 產(chǎn)α-淀粉酶菌株篩選結(jié)果Table 1 Screening results of strain with α-amylase high yield

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株A-5-3接種至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d，觀察其形態(tài)特征結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌落生長速度快，菌落初期為淡黃色，有褶皺；后期菌落中央黃色，邊緣為白色菌絲，背面黃色。產(chǎn)生大量黑色分生孢子。結(jié)合顯微觀察和電鏡下觀察結(jié)果見圖2，初步鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）。

圖1 菌株A-5-3菌落形態(tài)特征Fig.1 Colonial morphological properties of strain A-5-3

圖2 分生孢子梗、分生孢子頭及分生孢子的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope of conidiophore,conidial head and conidia

2.2.2 18s rDNA基因的PCR擴(kuò)增

以提取的A-5-3的DNA為模板，以NS1、NS8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3，得到一條1 500bp左右的片段。將PCR產(chǎn)物送華大基因測序，結(jié)果顯示該片段長1 448bp，將測序結(jié)果用美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的Blast軟件進(jìn)行核苷酸同源性比對，得知該菌株與黑曲霉的18S rDNA的序列同源性為100%，因此將該菌株歸屬為黑曲霉（Aspergillus niger）。

圖3 PCR擴(kuò)增的18S rDNA電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of PCR amplified 18S rDNA

2.3 菌株A-5-3產(chǎn)酸性淀粉酶性質(zhì)研究

2.3.1 溫度對酶活力的影響

在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃測定粗酶液酶活，測得淀粉酶活性最大值為100%，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity

由圖4可知，菌株A-5-3所產(chǎn)淀粉酶反應(yīng)的最適溫度為70℃。

2.3.2 酶的熱穩(wěn)定性研究

粗酶液在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃保溫1h后，進(jìn)行酶促反應(yīng)，以不保溫酶液為對照，對照相對酶活值為100%，結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對酶的穩(wěn)定性影響Fig.5 Effects of temperature on enzyme stability

由圖5可以看出，在30℃、40℃、50℃條件下，該酶的熱穩(wěn)定性好，保溫1h后，剩余的相對酶活分別達(dá)到95.53%、98.55%、97.11%。當(dāng)溫度高于60℃時，酶活下降很快，到80℃時，剩余淀粉酶活力僅剩下最高酶活力的15%。

2.3.3 pH值對酶活力的影響

在pH 3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0條件下測酶活，結(jié)果見圖6。以活性最大值為100%，由圖6可知，酶的最適pH為3.6，pH 4.0、4.6時相對酶活分別為99.73%和99.69%，pH＞5.0時酶活迅速降低，pH值為3.0時相對酶活為71.12%。

2.3.4 酶的pH穩(wěn)定性研究

將酶液用不同pH值的緩沖液處理后測剩余酶活，結(jié)果見圖7。以未經(jīng)過處理的原酶液活力為100%，考察該酶的pH穩(wěn)定性，由圖7可知，該酶在pH 3.0～5.0非常穩(wěn)定，相對酶活≥85%。在pH＞6.0條件下，相對酶活力降低至50%以下。

圖6 pH值對酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on enzyme activity

圖7 pH值對酶的穩(wěn)定性影響Fig.7 Effect of pH on enzyme stability

2.3.5 金屬離子對酶活力的影響

在反應(yīng)體系中加入一定濃度的EDTA、MgCl2、CaCl2、BaCl2、ZnCl2、FeCl3、MnCl2、KCl、CoCl2溶液，使其在反應(yīng)體系中的濃度達(dá)到2mmol/L，以未處理原酶液為對照（CK）100%，考察金屬離子對酶活力的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知，Mn2+、K+對酶活有明顯的激活作用，相對酶活達(dá)到153%和121%；EDTA對酶活有明顯的抑制作用，相對酶活降至81%；Ca2+及其他金屬離子對酶活沒有明顯影響。

圖8 金屬離子對酶活力的影響Fig.8 Effect of metal ions on enzyme activity

3 結(jié)論

α-淀粉酶是水解淀粉酶類，是商品化生產(chǎn)最早、應(yīng)用最早、應(yīng)用范圍最廣和用量最大的工業(yè)酶類之一。耐酸性α-淀粉酶作為一種極端環(huán)境淀粉酶，可廣泛應(yīng)用于發(fā)酵、紡織、飼料、醫(yī)藥等多種領(lǐng)域，可以明顯地提高收得率，降低消耗，節(jié)約工業(yè)成本，具有很大的應(yīng)用潛力和開發(fā)前景。目前工業(yè)用的酸性α-淀粉酶大多來源于微生物，產(chǎn)酸性α-淀粉酶的微生物主要是芽孢桿菌和曲霉[8]，如酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌（B.acidocaldarius）A-2[9]，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌（B.acidocaldarius）ATCC2709[10]，地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）[11]，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌（B.acidocaldarius）101[12]，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）[13]，黑曲霉（Aspergillus niger）[14]，白曲霉（Aspegillus kawachii）[15]，疏綿狀嗜熱絲孢菌（Thermomyoes lanuginosus）[16]，嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus steorothermopilius）[17]等。黑曲霉是最早發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的菌株，在日本、歐洲等國已經(jīng)有用其進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用的報到。雖然這些微生物都能產(chǎn)生酸性α-淀粉酶，但是不同菌株產(chǎn)生的酶在耐酸性，耐熱性及淀粉的水解程度均有差異。大多數(shù)的酸性α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為50～60℃，其最適pH值為4.0～5.0。

本研究從釀造酒曲中分離篩選出的高產(chǎn)組選育的α-淀粉酶菌株A-5-3，經(jīng)初步鑒定為黑曲酶（Aspergillus niger）。通過對其產(chǎn)生α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究，表明該酶的最適作用溫度為70℃，熱穩(wěn)定性良好；最適作用pH值為3.6，該酶在pH 3.0～5.0范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定，當(dāng)pH 3.0時，有71%的酶活；Mn2+、K+離子對此酶有激活作用，EDTA有明顯的抑制作用，Ca2+對該酶沒有明顯的作用。與國內(nèi)已報道文獻(xiàn)相比，該酶的活力較高，且不依賴Ca2+調(diào)控，能夠?qū)崿F(xiàn)在弱酸性條件下淀粉液化和糖化的同步進(jìn)行，從而簡化了淀粉加工工藝，節(jié)約了成本，具有良好的應(yīng)用前景。

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