楊奇盛 趙 剡 周賢龍 倪紹洲 沈 俊 王 翔 潘正啟 宋小兵

武漢大學(xué)中南醫(yī)院急救中心（武漢 430071）

大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)/復(fù)位引發(fā)CCDD44++TT細(xì)胞亞群失衡對(duì)生殖細(xì)胞凋亡的影響*

楊奇盛 趙 剡 周賢龍 倪紹洲 沈 俊 王 翔 潘正啟 宋小兵

武漢大學(xué)中南醫(yī)院急救中心（武漢 430071）

目的探討在大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)/復(fù)位過程中CD4+T細(xì)胞亞群Th1/Th2失衡對(duì)生殖細(xì)胞凋亡的影響。方法SD雄性成年大鼠30只，隨機(jī)分成假手術(shù)組、睪丸扭轉(zhuǎn)組和復(fù)位組，每組10只。通過建立左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)和扭轉(zhuǎn)復(fù)位動(dòng)物模型，在手術(shù)后24h分別取材，血清酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測血清干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素12（IL-12）、白細(xì)胞介素4（IL-4）和白細(xì)胞介素10（IL-10）水平；原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測各組左側(cè)睪丸生殖細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果與假手術(shù)組相比，扭轉(zhuǎn)組和扭轉(zhuǎn)復(fù)位組與Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12水平升高明顯（P＜0.05），Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平下降（P＜0.05）；生殖細(xì)胞凋亡指數(shù)增加。結(jié)論在大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)和復(fù)位過程中CD4+T細(xì)胞亞群偏移與生殖細(xì)胞凋亡存在相關(guān)性。

T淋巴細(xì)胞亞群; 精索扭轉(zhuǎn); 再灌注損傷; 細(xì)胞凋亡

Key woorrddssT-Lymphocyte Subsets; Spermatic Cord torsion; reperfusion injury; Apoptosis

睪丸扭轉(zhuǎn)是臨床常見的急癥，多發(fā)生于25歲前的青少年，必須緊急外科手術(shù)復(fù)位恢復(fù)睪丸血供[1]。在睪丸扭轉(zhuǎn)及復(fù)位過程中缺血再灌注損傷是臨床上常見的病理生理現(xiàn)象，是多因素參與的復(fù)雜病理過程，涉及到多個(gè)環(huán)節(jié)，其中免疫反應(yīng)是造成睪丸生精功能損害作用機(jī)制之一。CD4+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體主要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，主要有Th1和Th2兩種亞群[2]。本研究通過建立大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)/復(fù)位動(dòng)物模型，檢測血漿CD4+T細(xì)胞亞群相關(guān)因子變化及睪丸組織生殖細(xì)胞凋亡，探討CD4+T細(xì)胞亞群失衡變化趨勢(shì)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型的制作

健康成年SD雄性大鼠（SPF級(jí)，購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）、睪丸扭轉(zhuǎn)組（B組）和復(fù)位組（C組），每組10只。

睪丸扭轉(zhuǎn)動(dòng)物模型建立方法[3]：乙醚吸入麻醉，常規(guī)消毒，下腹部正中小切口，顯露左側(cè)睪丸并切斷睪丸引帶，分離筋膜至附睪頭，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)左側(cè)睪丸720°固定于腹壁并縫合傷口。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位動(dòng)物模型建立方法：順時(shí)針旋轉(zhuǎn)左側(cè)睪丸720°并維持2h期間夾閉傷口，2h后將扭轉(zhuǎn)睪丸復(fù)位固定于陰囊。

A組SD大鼠乙醚吸入麻醉后，下腹部正中小切口，顯露左側(cè)睪丸后縫合，術(shù)后飼養(yǎng)24h取材；B組左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)，術(shù)后飼養(yǎng)24h取材；C組左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)后復(fù)位，術(shù)后飼養(yǎng)24h取材。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）血清酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測

各組大鼠抽取頸靜脈血液，室溫靜置2h，3000r/ min離心15min后取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩LISA法檢測各組血漿中干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素12（IL-12）、白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素10（IL-10）的濃度（按試劑盒說明書操作）。

（二）睪丸生殖細(xì)胞凋亡檢測

取各組大鼠左側(cè)睪丸組織，4%多聚甲醛固定睪丸組織后制作石蠟切片，檢測生殖細(xì)胞凋亡。采用原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測睪丸生殖細(xì)胞凋亡情況。凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，陰性對(duì)照不加末端轉(zhuǎn)化酶。凋亡指數(shù)（AI）計(jì)算：每張切片隨機(jī)選取100個(gè)生精小管橫切面(×400），計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，求得平均每生精小管橫切面凋亡細(xì)胞數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、EELLIISSAA檢測結(jié)果

各組ELISA檢測結(jié)果中，CD4+T細(xì)胞亞型Th1分泌的細(xì)胞因子IFN-γB組和C組分別與假A組比較，血清濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中C組較B組升高明顯（P＜0.05）。與促Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ相關(guān)的IL-12在B組和C組血漿中均升高，與A組比較升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中C組較B組升高明顯（P＜0.05），其變化與IFN-γ呈正相關(guān)。Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4、IL-10在B組和C組血清濃度均較A組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中IL-10在C組血清濃度與B組血清濃度比較降低明顯。然而IL-4在B組血清濃度高于C組血清濃度（P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠血清檢測結(jié)果及扭轉(zhuǎn)睪丸組織凋亡指數(shù)比較

二、生殖細(xì)胞凋亡檢測

各組均取左側(cè)睪丸組織行TUNLE檢測，發(fā)生凋亡的細(xì)胞核被染成棕黃色。A組凋亡細(xì)胞較少，B組和C組左側(cè)睪丸組織凋亡生殖細(xì)胞明顯增多。B組和C組生殖細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1。

圖1 各組大鼠左側(cè)睪丸生殖細(xì)胞凋亡程度比較

討 論

睪丸扭轉(zhuǎn)造成睪丸組織缺血，對(duì)睪丸生精上皮及間質(zhì)均造成不同程度的損害，導(dǎo)致睪丸生殖細(xì)胞凋亡，同時(shí)全身或睪丸局部在抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cells）輔助作用下使淋巴細(xì)胞抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)[4]。初始的CD4+T細(xì)胞按照細(xì)胞因子分泌模式和生物學(xué)功能主要分為Th1細(xì)胞和Th2 細(xì)胞亞群。Th1/Th2細(xì)胞亞群間處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體發(fā)生損傷時(shí)， Th1/Th2 之間的平衡狀態(tài)被打破，分泌不同的細(xì)胞因子，啟動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，進(jìn)而造成疾病的產(chǎn)生和發(fā)展[5]。

在睪丸扭轉(zhuǎn)過程中，生殖細(xì)胞損害程度主要取決于扭轉(zhuǎn)程度和扭轉(zhuǎn)持續(xù)的時(shí)間，這兩個(gè)方面決定著睪丸的缺血程度。隨著扭轉(zhuǎn)時(shí)間的延長，睪丸生精功能的受損程度逐步加重[6]。睪丸扭轉(zhuǎn)后的病理學(xué)損害表現(xiàn)為：睪丸組織充血水腫，生精上皮變薄，生精上皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞層次及數(shù)量減少。初級(jí)精母細(xì)胞內(nèi)可見染色質(zhì)濃縮和邊聚，形態(tài)異常，部分圓形精子細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞從生精上皮脫落入生精小管。睪丸扭轉(zhuǎn)遠(yuǎn)期結(jié)果則可出現(xiàn)睪丸萎縮，生精停滯。隨著扭轉(zhuǎn)時(shí)間的延長，間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞也逐漸受到影響[7]。睪丸扭轉(zhuǎn)對(duì)睪丸的損傷主要包括生精上皮細(xì)胞凋亡，間質(zhì)細(xì)胞萎縮，精子生成減少且形態(tài)異常，以及支持細(xì)胞的病理改變。

組織缺血再灌注機(jī)制尚未完全闡明，但目前認(rèn)為它是多因素參與下的損傷性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。睪丸缺血再灌注時(shí)在局部血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后引起Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子干擾素γ、腫瘤壞死因子-β 和IL-2等介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞組織相關(guān)抗原Ⅱ分子的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的遞呈和自身活化，加重組織的免疫炎性反應(yīng)，進(jìn)一步加重睪丸組織的損害，甚至出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征[8]。IL-12可以促使CD4+T淋巴細(xì)胞由初始的Th0分化為Th1細(xì)胞，促Th1細(xì)胞分泌干擾素γ增加，強(qiáng)化Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答[9]。在此損害同時(shí)存在Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4、IL-10和IL-13等通過B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，促B細(xì)胞產(chǎn)生抗體保護(hù)機(jī)體免受炎性損傷，保護(hù)睪丸組織減輕免疫病理損害。同時(shí)，Th2細(xì)胞因子IL-4能抑制巨噬細(xì)胞的活性，阻斷干擾素-γ活化巨噬細(xì)胞后的效應(yīng)，因此能減緩有巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[10]。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在睪丸扭轉(zhuǎn)缺血再灌注過程中，CD4+T淋巴細(xì)胞由Th0分化為Th1細(xì)胞亞型增多，并促Th1細(xì)胞分泌干擾素γ增加的IL-12升高明顯，與Th1細(xì)胞亞型分泌細(xì)胞因子干擾素γ成正相關(guān)。Th2細(xì)胞亞型分泌的細(xì)胞因子在缺血再灌注過程中分泌減少，IL-4在缺血階段分泌較再灌注時(shí)分泌增加，這可能與在損傷過程中Th2細(xì)胞分泌IL-4抑制Th1細(xì)胞分泌干擾素γ作用有關(guān)。在睪丸缺血再灌注病理過程中，患側(cè)睪丸生殖細(xì)胞凋亡明顯。

在睪丸缺血再灌注過程中，CD4+T淋巴細(xì)胞亞群之間的平衡發(fā)生偏移，Th1細(xì)胞亞型介導(dǎo)的細(xì)胞免疫占主導(dǎo)作用，其分泌細(xì)胞因子增多，Th2細(xì)胞亞型分泌受到抑制，這與生殖細(xì)胞凋亡存在正相關(guān)性。

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（2013-08-01收稿）

Effects of unbalance CD4+T cell subgroups on germ cell apoptosis during rat testicular torsion＊

Yang Qisheng, Zhao Yang, Zhou Xianlong, Ni Shaozhou, Shen Jun,Wang Xiang, Pan Zhengqi, Song Xiaobing
Department of Emergency ,Zhongnan Hospital of Wuhan University,Wuhan 430071,China

ObjectiveeTo investigate the effects of the unbalance of CD4+T cell subgroups on germ cell apoptosis during rat testicular torsion.MetthhooddssMale SD rats were randomly divided into three groups and there were 10 rats in each group. For rats in sham operation group, they served as the control; For rats in left unilateral testicular torsion group, their left testes were rotated 720 degree for 2 hours; For rats in left testicular torsion reset group, their testes were reseted after 2 hours testicular torsion. At 24 hours after operation, levels of serum cytokines IFN-γ, IL-12, IL-4 and IL-10 were measured by ELISA. Germ cell apoptosis index in left testes of the rats was determined by TUNEL.RessuullttssCompared with that of the sham operation group, the levels of Th1 type cytokines were signifi cantly increased in torsion and detorsion groups(P＜0.05). The levels of Th2 type cytokines such as IL-4, IL-10 were obviously lower in torsion and detorsion groups than that in sham operation group (P＜0.05). CD4+T cell subgroups was unbalance during testicular torsion in rats. The apoptosis index of germ cells was signifi cantly higher in torsion and detorsion groups than that of sham operation group.ConcluussiioonnCD4+T cell subgroups is unbalance in ischemia reperfusion injury in rat testis, which may be associated with germ cell apoptosis.

R 697.2

資助∶ 湖北省自然科學(xué)基金（項(xiàng)目號(hào)2011CHB026）

ddooii∶10.3969/j.issn.1008-0848.2014.02.003