田洪艷 李質(zhì)馨徐 冶 潘曉燕 王弘珺 劉忠平 林冬靜

吉林醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（吉林 132013）

蒺藜提取物對(duì)小鼠睪丸熱損傷后NOS-NO系統(tǒng)的影響*

田洪艷 李質(zhì)馨**徐 冶 潘曉燕 王弘珺 劉忠平 林冬靜

吉林醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（吉林 132013）

目的觀察蒺藜提取物對(duì)小鼠熱損傷睪丸一氧化氮合酶（NOS）-一氧化氮（NO）系統(tǒng)的影響，探討蒺藜對(duì)小鼠熱損傷睪丸的保護(hù)修復(fù)作用機(jī)制。方法健康雄性小鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和給藥組，每組10只；建立睪丸熱損傷模型，給予治療劑量的蒺藜提取物；睪丸NOS活力和NO含量測(cè)定；睪丸NOS 和caspase-3免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡觀察；酶聯(lián)法檢測(cè)血清中睪酮含量。結(jié)果模型組與對(duì)照組相比睪丸組織NOS活力和NO含量明顯升高，睪丸iNOS陽性表達(dá)明顯增加，睪丸caspase-3陽性細(xì)胞明顯增多，血清睪酮含量明顯降低。給藥組與模型組相比睪丸組織NOS活力和NO含量明顯降低，睪丸iNOS陽性表達(dá)明顯減少，睪丸caspase-3陽性細(xì)胞明顯減少，血清睪酮含量明顯升高。結(jié)論 蒺藜提取物通過調(diào)控NOS-NO系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠熱損傷睪丸的保護(hù)修復(fù)作用。

蒺藜; 熱損傷; 睪丸; 一氧化氮合酶; 一氧化氮

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的氣體信號(hào)分子，由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成，可由多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生。NO以自分泌和旁分泌形式作用于組織細(xì)胞，參與機(jī)體多種生理和病理反應(yīng)過程[1,2]。NO的生物半衰期僅數(shù)秒,因此細(xì)胞產(chǎn)生NO量的多少關(guān)鍵取決于NOS的活性。目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)3種亞型NOS，即神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）。NO在生殖系統(tǒng)中的作用已被廣大學(xué)者所關(guān)注，研究表明NO與陰莖勃起、睪丸微循環(huán)調(diào)節(jié)、雄激素分泌、精子成熟、運(yùn)動(dòng)及獲能等生殖活動(dòng)均有密切關(guān)系[3-6]。中醫(yī)學(xué)指出蒺藜具有促進(jìn)精子產(chǎn)生、提高生殖能力等作用，但這僅限于中醫(yī)臨床觀察，且只是表征的描述。本文是從睪丸NOS-NO系統(tǒng)的變化，探討蒺藜提取物對(duì)小鼠熱損傷睪丸的保護(hù)修復(fù)作用機(jī)制。

材料和方法

一、材料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

選用健康清潔級(jí)ICR雄性小鼠，30只，體質(zhì)量（25±2）g，購自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將30只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和給藥組，每組10只，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為18～22℃，相對(duì)濕度45%～55%，規(guī)律光照，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

（二）主要試劑與儀器

蒺藜提取物，棕黃色粉末，陜西森弗生物技術(shù)有限公司；多聚甲醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NOS測(cè)定試劑盒、NO測(cè)試盒和考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；睪酮（testosterone，T）ELISA檢測(cè)試劑盒，美國；兔抗鼠iNOS多克隆抗體、兔抗鼠caspase-3多克隆抗體、SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。三用恒溫水箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TDZ5-WS型離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)有限公司；MK3型酶標(biāo)儀，美國熱電公司；723型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；微量電動(dòng)勻漿器，美國kimble公司；Leica-RM2245石蠟切片機(jī)，德國；OLYMPUS-DP71數(shù)碼顯微鏡，日本。

二、方法

（一）建立動(dòng)物模型

小鼠均用0.4%戊巴比妥鈉0.8～1.2mL/只，腹腔注射麻醉。熱處理參照Lue等方法[7]，模型組和給藥組小鼠麻醉后，陰囊浸于43℃恒溫水浴中，20min；對(duì)照組小鼠麻醉后，陰囊浸于22℃恒溫水浴中，20min。各組均于熱處理前4天開始灌胃，每天1次；給藥組灌服蒺藜提取物，390mg/kg；對(duì)照組和模型組灌服等量的蒸餾水；連續(xù)灌胃至熱處理后3d，取材進(jìn)行標(biāo)本制備。

（二）血清T含量測(cè)定

0.4%戊巴比妥鈉0.8～1.2mL/只，腹腔注射麻醉；心臟穿刺取血；分離血清；酶聯(lián)法檢測(cè)血清中T含量，檢測(cè)方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

（三）睪丸NOS活力和NO含量測(cè)定

處死小鼠，立即取睪丸，經(jīng)預(yù)冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干，除去皮下脂肪和其他結(jié)締組織，稱量；量取該組織塊9倍質(zhì)量的預(yù)冷生理鹽水，用微量電動(dòng)勻漿器制成10%組織勻漿；反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞完全破碎，內(nèi)容物完全游離在液相中；離心，取上清液；測(cè)定NOS活力和NO含量，測(cè)定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

（四）NOS免疫組織化學(xué)染色

取睪丸，放入4%多聚甲醛中固定；常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋；石蠟切片機(jī)切片，5μm。釆用SABC法進(jìn)行iNOS免疫組織化學(xué)染色。染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，用正常非免疫血清代替一抗作替代對(duì)照，用不加一抗的緩沖液作空白對(duì)照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光學(xué)顯微鏡下觀察。iNOS免疫組織化學(xué)染色陽性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)。用Image-Pro Plus分析軟件對(duì)iNOS的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每組隨機(jī)選取30個(gè)視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度。

（五）caspase-3免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片制作同上，釆用SABC法進(jìn)行caspase-3免疫組織化學(xué)染色。染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，用正常非免疫血清代替一抗作替代對(duì)照，用不加一抗的緩沖液作空白對(duì)照， DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察，caspase-3陽性細(xì)胞呈棕黃色。每組隨機(jī)選取30個(gè)視野（×200），計(jì)數(shù)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，釆用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異性檢驗(yàn)，分析前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、睪丸NOS活力的變化

對(duì)照組睪丸組織NOS活力為（1.337±0.057）U/mg prot；模型組睪丸組織NOS活力為（2.370± 0.065）U/mg prot，與對(duì)照組比較活力明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；給藥組睪丸組織NOS活力為（1.547±0.052）U/mg prot，與模型組比較活力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

二、睪丸NO含量的變化

對(duì)照組睪丸組織NO含量為（3.192±0.067）μmol/g prot；模型組睪丸組織NO含量為（4.272± 0.073）μmol/g prot，與對(duì)照組比較含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；給藥組睪丸組織NO含量為（3.377±0.071）μmol/g prot，與模型組比較含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

三、睪丸iNOS陽性細(xì)胞的表達(dá)

睪丸iNOS陽性細(xì)胞為多邊形，核圓居中，胞質(zhì)呈棕黃色，主要分布于睪丸間質(zhì)（圖1）。對(duì)照組iNOS陽性細(xì)胞數(shù)量少，胞質(zhì)顯色淡，iNOS陽性反應(yīng)的平均光密度為0.1386±0.0076；模型組iNOS陽性細(xì)胞數(shù)量增多，胞質(zhì)顯色較深，iNOS陽性反應(yīng)的平均光密度為0.2173±0.0145，明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；給藥組iNOS陽性細(xì)胞數(shù)量減少，胞質(zhì)顯色較淡，iNOS陽性反應(yīng)的平均光密度為0.1637± 0.0073，明顯低于模型組（P＜0.01）。

四、睪丸caspase-3陽性細(xì)胞的變化

caspase-3陽性細(xì)胞呈棕黃色，主要分布于生精細(xì)胞（圖2）。對(duì)照組caspase-3陽性細(xì)胞少，caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)為1.167±0.986；模型組caspase-3陽性細(xì)胞增多，caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)為9.433±1.775，明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；給藥組caspase-3陽性細(xì)胞減少，caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)為3.133±1.196，明顯低于模型組（P＜0.01）。

五、血清T含量的變化

對(duì)照組血清T含量為（1.926±0.056）ng/mL；模型組血清T含量為（1.298±0.052）ng/mL，與對(duì)照組比較含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；給藥組血清T含量為（1.803±0.072）ng/mL，與模型組比較含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 各組小鼠睪丸iNOS陽性細(xì)胞（SABC法）

圖2 各組小鼠睪丸caspase-3陽性細(xì)胞（SABC法）

討 論

NO一方面作為一種信使分子參與體內(nèi)的各種重要生理功能[1]；另一方面NO還是一種細(xì)胞毒性分子，可造成組織細(xì)胞損傷，過多的NO生成與某些疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8]。NO具有良好的親脂性，可快速通過細(xì)胞膜擴(kuò)散，到達(dá)鄰近靶細(xì)胞發(fā)揮作用。NO在體內(nèi)的作用，可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶（GC），使環(huán)鳥甘酸（cGMP）升高而完成；也可以與體內(nèi)眾多生物分子直接發(fā)生反應(yīng)而參與，這時(shí)不依賴cGMP。機(jī)體對(duì)NO作用的調(diào)節(jié)主要是通過對(duì)NOS的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)，NOS是唯一催化NO合成的酶分子，目前已純化了3種同工酶（nNOS、iNOS，eNOS），從功能上可把NOS分為結(jié)構(gòu)型（nNOS、eNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）兩種。nNOS和eNOS是通過機(jī)體對(duì)Ca2+水平的控制而低水平持續(xù)表達(dá)，使NO維持在低濃度發(fā)揮生理功能；iNOS可通過誘導(dǎo)合成，一旦合成即產(chǎn)生大量NO。iNOS是引起體內(nèi)NO過量產(chǎn)生的主要基礎(chǔ)，大量NO可以造成組織和細(xì)胞的損害甚至死亡，所以iNOS的誘導(dǎo)合成就成為眾多疾病的發(fā)病關(guān)鍵[8]。NO對(duì)雄性生殖功能亦具有重要的調(diào)節(jié)作用，與男性不育有著密切的關(guān)系。因此，近年來對(duì)NO的研究越來越受到廣大生殖醫(yī)學(xué)工作者的重視[3-6]。在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到模型組與對(duì)照組相比NOS活力和NO含量明顯升高，睪丸iNOS陽性表達(dá)增加；給藥組與模型組相比NOS活力和NO含量明顯降低，睪丸iNOS陽性表達(dá)明顯減少；表明蒺藜提取物可通過調(diào)控睪丸組織NOS-NO系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠熱損傷睪丸的保護(hù)修復(fù)作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理和病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序自己結(jié)束生命的過程。細(xì)胞凋亡不僅參與生物體的生長發(fā)育，也介導(dǎo)了一些疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來，生精細(xì)胞凋亡的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)，尤其是對(duì)不育癥的研究也給予了較多關(guān)注[9,10]。隨著細(xì)胞凋亡機(jī)制和調(diào)控的闡明，將有助于探討生精細(xì)胞凋亡與男性不育的關(guān)系。研究表明NOS和NO參與睪丸組織細(xì)胞的分化和凋亡的調(diào)控，NOS缺乏或NOS表達(dá)增強(qiáng)可以減少或增加細(xì)胞凋亡[11,12]。高濃度的NO是一種重要的凋亡誘導(dǎo)因子。NO可直接損傷細(xì)胞的DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；NO與O2-?結(jié)合生成ONOO-，后者可直接或通過分解成許多小分子毒性物質(zhì)損傷細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；NO可影響多種凋亡相關(guān)基因而誘導(dǎo)凋亡。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一，可以剪切細(xì)胞凋亡過程中的許多關(guān)鍵蛋白，caspase-3的激活常被作為細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)。在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到模型組與對(duì)照組相比，caspase-3陽性細(xì)胞明顯增多，同時(shí)睪丸組織NOS活力和NO含量顯著增高，睪丸iNOS陽性表達(dá)增加；給藥組與模型組相比，caspase-3陽性細(xì)胞明顯減少，同時(shí)睪丸組織NOS活力和NO含量明顯降低，睪丸iNOS陽性表達(dá)明顯減少；表明蒺藜提取物可通過NOS-NO系統(tǒng)調(diào)控睪丸生殖細(xì)胞的凋亡。

精子發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜的細(xì)胞分裂分化過程，并且易受到許多內(nèi)、外源性致病因素的影響[13,14]。睪丸各細(xì)胞間存在著復(fù)雜的旁分泌調(diào)節(jié)機(jī)制，許多細(xì)胞還有自分泌調(diào)節(jié)功能。睪丸生精上皮中的生精細(xì)胞是在許多旁分泌因子及自分泌因子形成的局部激素環(huán)境中進(jìn)行增殖、分裂和分化的。睪酮是啟動(dòng)和維持精子發(fā)生的最重要激素，睪酮形成后被動(dòng)擴(kuò)散入生精上皮，與雄激素結(jié)合蛋白結(jié)合，促進(jìn)精子發(fā)生。研究結(jié)果證實(shí)，睪酮分泌與NO關(guān)系密切，NO對(duì)睪酮的分泌具有雙向調(diào)節(jié)作用。NO在低濃度時(shí)可以通過cGMP介導(dǎo)作用刺激睪酮的分泌，在高濃度時(shí)則抑制睪酮的分泌[15]。在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到模型組與對(duì)照組比較，小鼠血清T含量明顯降低，同時(shí)睪丸組織NOS活力和NO含量顯著增高，睪丸iNOS陽性表達(dá)增加；給藥組與模型組比較，小鼠血T含量明顯升高，同時(shí)睪丸組織NOS活力和NO含量明顯降低，睪丸iNOS陽性表達(dá)明顯減少；表明蒺藜提取物可通過NOS-NO系統(tǒng)調(diào)控T的分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)精子的發(fā)生。

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（2014-09-15收稿）

Effects of tribulus terrestris extract on the nos-no system of the thermal-injured testis in mice*

Tian Hongyan, Li Zhixin**, Xu Ye, Pan Xiaoyan,Wang Hongjun, Liu Zhongping, Lin Dongjing
Department of Histology and Embryology,Jilin Medical College,Jilin 132013,China

Li Zhixin, E-mail: lzx-62@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of Tribulus Terrestris extract on the NOS-NO system of the thermalinjured testis in mice, and explore its mechanism.MethodsAll 30 healthy male mice were randomly divided into the control group, the model group and the treated group, 10 mice per group. The thermal-injured testis models of mice were established and then were administrated with dose of Tribulus terrestris extract. NOS activity and NO content of the testis were measured. Levels of testicular NOS and Caspase-3 were detected by immunohistochemistry. The content of testosterone in serum was detected by ELISA.ResultsCompared with that of the control group, activities of NOS and the content of NO in testicular tissues were increased signif cantly in the model group. The positive expression of iNOS and the number of testicular Caspase-3 positive cells were also increased obviously, but the serum concentration of testosterone was decreased. Compared with that of the model group, activities of NOS and the content of NO of the testicular tissue were decreased in the treated group. The positive expression of iNOS and the number of testicular Caspase-3 positive cells were also decreased signif cantly, but the serum concentration of testosterone was increased.ConclusionTribulus terrestris extract shows protect effects on the thermal-injuried testis in mice by regulating the NOS-NO system.

tribulus terrestris; thermal injuries; testis; nitric oxide synthase; nitric oxide

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.11.003

R 329.464; R 594.1

資助: 吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助（2012484，2012485，2013477）;吉林省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012年）
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, E-mail: lzx-62@163.com