陳厚仰仇克清孫 捷黃志輝應(yīng)志偉吳麗萍曾 韓伍瓊芳**

1. 江西省婦幼保健院輔助生殖中心（南昌 330006）; 2. 南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院

穿膜肽EGFP的構(gòu)建及其對人成熟精子的穿膜活性鑒定*

陳厚仰1仇克清2孫 捷1黃志輝1應(yīng)志偉1吳麗萍1曾 韓1伍瓊芳1**

1. 江西省婦幼保健院輔助生殖中心（南昌 330006）; 2. 南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院

目的構(gòu)建穿膜肽TAT與EGFP融合蛋白的原核表達系統(tǒng)，研究該融合蛋白對人成熟精子的穿膜作用和對精子運動參數(shù)的影響。方法以pEGFP-N1載體為模板，設(shè)計N端和C端含有TAT序列的引物，用PCR技術(shù)擴增TAT-EGFP和EGFP-TAT基因，擴增產(chǎn)物插入載體 pET28a，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFPTAT。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DE3中，IPTG 誘導(dǎo)TAT-EGFP和EGFP-TAT融合蛋白表達。表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后SDS-PAGE電泳鑒定。將融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT分別加入正常人精子中孵育，熒光顯微鏡觀察融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT穿膜情況。結(jié)果成功構(gòu)建了高表達重組質(zhì)粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT，純化了分子質(zhì)量約為32 kD 的融合蛋白 TAT-EGFP和EGFP-TAT。融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT在正常人成熟精子中有穿膜作用。不同濃度的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT對正常人成熟精子存活率及運動參數(shù)無明顯影響。結(jié)論 通過對融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT表達純化及活性分析，證實穿膜肽TAT在精子中的跨膜轉(zhuǎn)運作用，為將來精子研究提供了實驗基礎(chǔ)。

細胞穿膜肽; 綠色熒光蛋白; 精子

近年來研究熱點之一細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs），也稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域 （protein translocation domain, PTD）或“特洛伊木馬”肽（Trojan horse peptides）或轉(zhuǎn)導(dǎo)肽 （transduction peptide）等，是一種高度陽離子短肽。穿膜肽具有強大的運載潛能[1]，可以通過化學(xué)結(jié)合或基因融合等方式攜帶各種生物大分子（蛋白質(zhì)、多肽、DNA、化學(xué)小分子藥物、反義核酸、肽核酸、納米顆粒、熒光素、有機分子、腺病毒載體、成像物質(zhì)、脂質(zhì)體及鐵顆粒等），運載能力可以達到120 kDa（如半乳糖苷酶）、40 nm（如鐵顆粒），其對宿主細胞無顯著毒副作用。穿膜肽TAT是1988年被Green[2]發(fā)現(xiàn)并證實的具穿膜功能的多肽分子，來源于人免疫缺陷病毒（HIV-1）的反式激活蛋白，是其中被稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的一段特殊氨基酸序列（49～57位氨基酸）（RKKRRQRRR），它是最經(jīng)典的CPPs。然而，利用穿膜肽攜帶目標(biāo)蛋白進行精子功能的研究仍未見報道。由于成熟精子特殊的結(jié)構(gòu)，有必要證實穿膜肽攜帶目標(biāo)蛋白進入精子內(nèi)的有效性，為有關(guān)功能研究提供依據(jù)。穿膜肽能否成功作為一種適用范圍廣、生物毒性小且轉(zhuǎn)運效率高的理想載體，我們把增強型綠色熒光蛋白（enhanced green f uorescent protein，EGFP）作為報告蛋白，通過構(gòu)建TAT與EGFP的融合表達載體，表達和純化穿膜肽EGFP融合蛋白后與正常人成熟精子孵育，觀察其穿膜效率以及對精子的存活率及各項運動參數(shù)的變化，為研究人成熟精子尋找新的途徑。

材料與方法

一、材料

（一）質(zhì)粒、菌株和細胞

質(zhì)粒pEGFP-N1（clontech）、pET28a（novegen）、菌株E.coli感受態(tài)細胞TOP10、BL21(DE3)均為本實驗室保存。

（二）主要試劑和儀器

HTF培養(yǎng)基（Millipore），EGFP（Biovision），BamHI、NdeI、XhoI等限制性內(nèi)切酶（Fermentas），Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶（上海依祥），胰化蛋白胨、酵母提取物（OXOID公司），質(zhì)粒及膠回收試劑盒（Axygen公司），Ni-NTA親和層析柱（GE 公司），DMSO、BSA等（Sigma公司），DNA Ladder（北京天根），伊紅染色試劑盒（安徽安科），引物合成及測序（上海生工），凝膠成像分析儀（BioRaid），激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS公司），臺式高速冷凍離心機（Eppendorf），PCR儀（ABI2720），酶標(biāo)儀（Biorad），熒光顯微鏡（OLYMPUS公司）。

（三）精液標(biāo)本的收集和檢測

由我院輔助生殖中心收集，與患者溝通同意后簽署知情同意書。CASA分析符合 WHO（第五版）規(guī)定的正常標(biāo)準(zhǔn)。

二、方法

（一）重組質(zhì)粒 pET28a-TAT-EGFP和 pET28a-EGFP-TAT的構(gòu)建

構(gòu)建pET28a-TAT-EGFP重組質(zhì)粒：根據(jù)EGFP 基因序列和載體pET28的特性，設(shè)計引物EGFPN上游5'端分別加入了保護堿基GGG、NdeI酶切位點（CATATG）、TAT 序列和BamHI酶切位點（GGATCC）（引物設(shè)計序列詳見表1），以pEGFP-N1載體為模板，加入引物EGFPN引物，PCR特異性擴增出TAT-EGFP片段。擴增體系為25μL體系，擴增步驟為：95℃5min預(yù)變性；95℃ 30s，58℃30s，72℃1.5min，25循環(huán)；72℃7min延伸。產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后進行NdeI和XhoI雙酶切，跑膠、切膠回收得到小片段TATEGFP。同時將載體pET28a進行同樣條件下的雙酶切。將酶切后的TAT-EGFP與線性載體pET28a用T4 連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞TOP10，挑選陽性克隆培養(yǎng)并行菌落PCR和測序，鑒定插入的TAT-EGFP片段序列無誤后,提取質(zhì)粒，-70℃保存。

表1 引物設(shè)計序列

構(gòu)建pET28a-EGFP-TAT重組質(zhì)粒：設(shè)計引物EGFPC下游5'端加入了保護堿基CCG 、XhoI酶切位點（CTCGAG）、TAT序列和BamHI酶切位點（GGATCC），參照構(gòu)建pET28a-TAT-EGFP重組質(zhì)粒方案構(gòu)建pET28a-EGFP-TAT重組質(zhì)粒。

（二）TAT-EGFP和EGFP-TAT在大腸桿菌中的表達及純化

將重組質(zhì)粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP -TAT轉(zhuǎn)化菌株E.coli感受態(tài)細胞BL21（DE3）中，培養(yǎng)后涂布于含有卡那霉素的LB平皿中，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落至4 ml LB 培養(yǎng)液中放大培養(yǎng)，細菌菌濃度至OD600=0.6左右時，加入IPTG誘導(dǎo)，終濃度為0.5mM（同時留一管不誘導(dǎo)作為對照），收集菌液后使用超聲裂菌，待細菌沉淀變澄清，13000rpm，4℃，離心30min，收集上清用Ni-NTA親和層析柱純化，250 mmol/L咪唑洗脫結(jié)合于柱上的蛋白，收集蛋白峰用PBS透析后，純化產(chǎn)物進行SDSPAGE電泳分析。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，通過分光光度計測OD595讀數(shù)與蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得制備純化蛋白的濃度。

（三）融合蛋白的穿細胞膜作用

收集正常人成熟精子，離心，用PBS重懸，洗滌3次，最后用HTF液重懸沉淀。將融合蛋白TAT-EGFP和EGFP -TAT純化后無菌過濾，調(diào)整濃度為1μmol/L、5μmol/L，加入已處理好的正常人成熟精子中，設(shè)空白、EGFP對照，放入CO2培養(yǎng)箱中孵育1h和2h，取出后PBS清洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察。

（四）融合蛋白對精子存活率及各項運動參數(shù)的影響

加入TAT-EGFP和EGFP-TAT使終濃度分別為1μmol/L和5μmol/L，設(shè)置空白、EGFP對照，放入CO2培養(yǎng)箱中孵育2h。按照伊紅染色試劑盒說明書檢測加入融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT后對精子存活率的影響，同時利用CASA檢測加入融合蛋白TATEGFP和EGFP-TAT后精子運動參數(shù)的變化情況。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、重組質(zhì)粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP -TAT的鑒定

PCR擴增出約為776bp片斷，與預(yù)期結(jié)果相符，跑膠、切膠回收備用（見圖1A）。將回收的擴增片段和pET28a載體行NdeI和XhoI雙酶切，跑膠、切膠回收（見圖1B）。在連接酶作用下，將經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切后的線性化pET28a質(zhì)粒和擴增片段連接，并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細菌，挑取平板上陽性單菌落、搖菌后行菌液PCR（見圖2A）。陽性克隆提取質(zhì)粒測序證實所插入基因片段無突變，與GenBank中序列一致（見圖2B）。結(jié)果證實重組質(zhì)粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP –TAT構(gòu)建成功。

圖1 分子克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP -TAT

圖2 陽性克隆菌液PCR和測序驗證

二、融合蛋白TAT-EGFP和EGFP -TAT的表達、純化與鑒定

選取高表達的陽性克隆子大量表達融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白，在相對分子質(zhì)量約為32kD左右出現(xiàn)一條強表達帶，符合預(yù)期分子質(zhì)量大?。ㄒ妶D3A）。用Ni-NTA親和層析柱純化融合蛋白TAT-EGFP和 EGFP-TAT，取樣品跑SDS-PAGE（見圖3B），通過ImageJ圖像分析軟件分析，其純度（93.2± 3.5）%。根據(jù)牛血清白蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.0226X+0.0194，根據(jù)純化蛋白溶液測得的平均吸光度值計算出純化TATEGFP濃度為（0.35±0.03）mg/mL，EGFP-TAT為（0.42±0.04）mg/mL。

圖3 融合蛋白SDS-PAGE鑒定

三、蛋白穿細胞膜作用的檢測

不同濃度的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT分別加入精子中，孵育1h和2h，在熒光顯微鏡下觀察到精子呈現(xiàn)出清晰明亮的綠色熒光蛋白，孵育時間越長，熒光越強；而EGFP對照組和空白對照組精子中未見熒光（見圖4）。不同濃度組內(nèi)和組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，不同孵育時間組內(nèi)和組間比較差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（見表2），即濃度越高，穿膜效率無明顯增強，孵育時間越長并未增加穿膜效率。

圖4 不同濃度融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT與精子孵育不同時間的穿膜效果圖

表2 不同濃度的融合蛋白與正常精子孵育不同時間穿膜效率的比較（±s，%）

表2 不同濃度的融合蛋白與正常精子孵育不同時間穿膜效率的比較（±s，%）

孵育 TAT-EGFP(μmol/L) EGFP-TAT (μmol/L)時間(h) 1 5 1 5 1 60.88±3.59 65.27±4.63 59.95±2.57 63.12±5.67 2 63.69±5.58 66.40±3.58 63.38±4.60 65.15±3.63

四、融合蛋白對精子存活率及各項運動參數(shù)的影響檢測

不同濃度的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT與正常人成熟精子作用2h后精子存活率和運動各項參數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表3）。融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT在一定范圍濃度里對正常人成熟精子無明顯影響。

討 論

EGFP 是綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的一種優(yōu)化突變體，在480 nm波長的激發(fā)下EGFP可發(fā)射出比GFP亮35倍的綠色熒光，與其他蛋白的融合并不影響其發(fā)光，而且不需要任何外源性底物和輔助因子，具有無毒、穩(wěn)定、無污染等優(yōu)良的物理特性，已作為報告分子廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究[3]。在多數(shù)細胞中，EGFP 熒光均勻的充滿胞漿、細胞核，在熒光顯微鏡下可直接觀察。本研究以EGFP為報告基因，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP -TAT，通過轉(zhuǎn)化到菌株E.coli感受態(tài)細胞BL21(DE3)中表達、提取得到TATEGFP和EGFP-TAT融合蛋白。純化后的TAT-EGFP和EGFP-TAT融合蛋白進行 SDS-PAGE蛋白電泳分析，表達的蛋白分子質(zhì)量約為32kD，與預(yù)期分子質(zhì)量大小一致。

精子功能正常與否，對臨床選擇體外受精（in vitro fertilization，IVF）治療不育癥極為重要。常規(guī)IVF需要功能完全正常的精子才能受精。臨床研究表明 IVF受精失敗的患者主要與精子功能障礙有關(guān)。目前國內(nèi)外對成熟精子的功能研究主要包括：精子獲能[4]、頂體反應(yīng)[5]、穿透能力及體外受精能力[6]等。精子獲能后精子高度活躍運動才具備發(fā)生頂體反應(yīng)的潛能，在 IVF 或體內(nèi)自然受精過程中，精子的頂體反應(yīng)是在結(jié)合到透明帶上，由透明帶糖蛋白受體誘發(fā)的。精子不完全同于一般細胞，是一種特化細胞。TAT已經(jīng)在腫瘤[7]、糖尿病[8]、免疫治療[9]等臨床領(lǐng)域展現(xiàn)出很大的研究價值，能搭載不同物質(zhì)進入不同細胞，比如巨噬細胞[10]、神經(jīng)元細胞[11]、成纖維細胞[12]，但在人精子方面的研究目前鮮有報道。

本研究設(shè)計引物成功表達N端和C端含有TAT的EGFP重組蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT，分別與正常人成熟精子孵育后，熒光顯微鏡下觀察到精子內(nèi)呈現(xiàn)出清晰明亮的綠色熒光，證實TAT能順利攜帶EGFP進入精子，這兩種融合蛋白均能進入精子中穿膜效率無明顯差異。EGFP作為對照組未發(fā)現(xiàn)穿細胞膜效應(yīng)。通過伊紅染色檢測精子的存活率，結(jié)果顯示添加融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT前后精子存活率無明顯變化；同時利用CASA檢測精子運動各項參數(shù)，結(jié)果表明在一定濃度范圍融合蛋白對精子存活率和各項運動參數(shù)無明顯影響。我們研究結(jié)果初步證實穿膜肽TAT在精子中可達到滿意的穿膜效果而且無明顯毒性作用，這為穿膜肽在精子方面的研究提供了實驗基礎(chǔ)。

表3 不同濃度融合蛋白與正常人成熟精子作用后各項運動參數(shù)檢測結(jié)果（±s）

表3 不同濃度融合蛋白與正常人成熟精子作用后各項運動參數(shù)檢測結(jié)果（±s）

注: PR為前向運動; VSL為直線速率; VCL為曲線速率

組別 例數(shù)(n) 孵育濃度(μmol/L) 存活率(%) 總活力(%) PR(%) VSL(μm/s) VCL (μm/s) TAT- EGFP 16 1 80.81±6.13 75.04±4.05 50.30±3.18 10.63±0.77 24.76±1.23 5 76.69±4.85 74.25±4.88 49.85±3.09 10.54±0.76 24.54±1.20 EGFP- TAT 16 1 77.50±4.03 74.62±3.03 50.06±3.18 10.56±0.77 24.60±1.20 5 78.44±5.91 71.42±3.93 50.28±3.18 10.69±0.75 24.80±1.22 EGFP 16 5 79.31±5.10 75.08±5.06 50.20±3.18 10.65±0.76 24.78±1.22空白 16 0 73.69±3.12 74.90±4.12 50.17±3.20 10.60±0.76 24.72±1.23

1 Wang F, Wang Y, Zhang X,et al. Recent progress of cellpenetrating peptides as new carriers for intracellular cargo delivery.J Control Release2014; 174: 126-136

2 Green M, Loewenstein PM. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodef ciency virus tat trans-activator protein.Cell1988; 55(6): 1179-1188

3 Pakhomov AA, Martynov VI. GFP family: structural insights into spectral tuning.Chem Biol2008; 15(8): 755-764

4 Aitken RJ, Nixon B. Sperm capacitation: a distant landscape glimpsed but unexplored.Mol Hum Reprod2013; 19(12): 785-793

5 Sagare-Patil V, Vernekar M, Galvankar M,et al. Progesterone utilizes the PI3K-AKT pathway in human spermatozoa to regulate motility and hyperactivation but not acrosome reaction.Mol Cell Endocrinol2013; 374(1-2): 82-91

6 Li MW, Kinchen KL, Vallelunga JM,et al. Safety, eff cacy and eff ciency of laser-assisted IVF in subfertile mutant mouse strains.Reproduction2013; 145(3): 245-254

7 Yuan W, Kuai R, Ran R,et al. Increased delivery of doxorubicin into tumor cells using extracellularly activated TAT functionalized liposomes: in vitro and in vivo study.J Biomed Nanotechnol2014; 10(8): 1563-1573

8 Lan MS, Chen C, Saunee NA,et al. Expression of biologically active TAT-fused recombinant islet transcription factors.Life Sci2014; 114(1): 45-50

9 Liu Y, Li F, Qi Z,et al. The effects of HIV Tat DNA on regulating the immune response of HIV DNA vaccine in mice.Virol J2013; 10: 297

10 Ma J, Xu J, Guan L,et al. Cell-penetrating peptides mediated protein cross-membrane delivery and its use in bacterial vector vaccine.Fish Shellf sh Immunol2014; 39(1): 8-16

11 Meloni BP, Craig AJ, Milech N,et al. The neuroprotective efficacy of cell-penetrating peptides TAT, penetratin, Arg-9, and Pep-1 in glutamic acid, kainic acid, and in vitro ischemia injury models using primary cortical neuronal cultures.Cell Mol Neurobiol2014; 34(2): 173-181

12 Wei Y, Li C, Zhang L,et al. Design of novel cell penetrating peptides for the delivery of trehalose into mammalian cells.Biochim Biophys Acta2014; 1838(7): 1911-1920

（2014-09-17收稿）

Construction of CPPs EGFP and verif cation of its transmembrane activity into human mature sperm*

Chen Houyang1, Qiu Keqing2, Sun Jie1, Huang Zhihui1, Ying Zhiwei1, Wu Liping1, Zeng Han1, Wu Qiongfang1**1. Reproductive Medical Center, Jiangxi Provincial Maternal and Child Health Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi, China;
2. The Third Aff liated Hospital of Nanchang University

Wu Qiongfang, E-mail: wuqiongfang898@sina.com

ObjectiveTo construct an prokaryotic expression system of cell-penptrating peptides（TAT）-enhanced green f uorescent protein fusion protein,and investigate its transmembrane effect on human mature sperm and the inf uence of sperm motility parametersin vitro.MethodsUsing pEGFP-N1 carrier as a template, the primers that contained TAT sequence of N-terminal and C-terminal respectively were designed. TAT-EGFP and EGFP-TAT gene were amplified by PCR,and its products were inserted into pET28a vector to construct recombinant plasmids pET28a-TAT-EGFP and pET28a-EGFP-TAT. The recombinant vectors were transformed into E.coli DE3.The fusion protein TAT-EGFP and EGFPTAT were induced by IPTG. The expressed fusion proteins were purif ed by Ni-NTA aff nity chromatography column and identif ed by SDS-PAGE electrophoresis. fusion proteins were added into human sperm in vitro toobserve transmembrane effect on human mature sperm.ResultsThe high expression pET28a-TAT-EGFP and pET28a-EGFP-TAT recombinant vectors were constructed successfully. The fusion protein TAT-EGFP and EGFP-TAT were purif ed,which molecular mass were approximately 32 kD. The fusion proteins showed transmembrane effect on human sperm. Different concentrations of the fusion proteins have no obvious inf uence on the survival rate and motion parameters of sperm.ConclusionThe transmembrane effect were conf rmed by the purif cation and activity analysis of the fusion protein TAT-EGFP and EGFPTAT,which provided a experimental basis for applying CPPs to human sperm．

cell-penetrating peptides; green f uorescent proteins; spermatozoa

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.11.002

R 321.1

資助: 江西省衛(wèi)生計生委普通科技計劃資助課題（20151119）
**

, E-mail: wuqiongfang898@sina.com