陳 芳，鄧雁如，郭利平

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市中藥化學(xué)與分析重點實驗室，天津300193）

·中藥研究·

HPLC法同時測定金銀花及金芪降糖片中9種成分的含量*

陳 芳，鄧雁如，郭利平

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市中藥化學(xué)與分析重點實驗室，天津300193）

[目的]建立高效液相色譜（HPLC）法同時測定金銀花及金芪降糖片中新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C 9種成分的含量。[方法]色譜柱為Waters SymmetryShieldTM RP18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-水（0.1%磷酸，B），線性梯度洗脫：0～5 min，10%～13%A；5～20 min，13%～15%A；20～30min，15%～18%A；30～45min，18%～20%A；45～52min，20%～23%A；52～70min，23%A，體積流量1.0mL/min，檢測波長327 nm；柱溫25℃。[結(jié)果]9種成分均能達到基線分離，線性關(guān)系良好，加樣回收率在95%～105%。在該方法下測定了16批金銀花藥材、11批金芪降糖片中9種成分的含量。[結(jié)論]該法專屬性強、靈敏度高、重復(fù)性好、簡便易行，可用于同時測定金銀花及金芪降糖片中新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C 9種成分的含量，可為金芪降糖片的現(xiàn)代制劑研究和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

金芪降糖片；金銀花；HPLC；新綠原酸；隱綠原酸；異綠原酸A

金芪降糖片是由金銀花、黃連和黃芪組成的一種純中藥制劑，具有清熱益氣，生津止渴等功效，主要用于氣陰兩虛并有內(nèi)熱癥候的糖尿病患者。該制劑中的金銀花為歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，其性寒，味甘，具有清熱解毒、通經(jīng)活絡(luò)、疏散風(fēng)熱之功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有抗菌抗病毒、解熱、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、利膽保肝、抗氧化、降血脂、止血等顯著功效[2-6]，其主要活性成分為有機酸類和黃酮類。金銀花中有機酸類成分主要包括綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸等[7-8]。黃酮類成分主要包括木犀草素、木犀草素-7-O-α-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷、金絲桃苷、蘆丁及5-羥基-3’，4’，7’-三甲基黃酮[9-10]。2010版《中國藥典》金銀花含量測定項分別測定了綠原酸及木犀草苷的含量[1]。目前，對金銀花的含量測定的報道中，大部分只測定了綠原酸和木犀草苷的含量[11]。本實驗室于靜等[11]曾同時測定金銀花及金芪降糖片中6種成分的含量，6種成分分別為綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、異綠原酸C。測定過程中，有一含量較高的成分因缺少對照品無法指認，后經(jīng)與對照品比對確認其為異綠原酸A，為體現(xiàn)中藥制劑多成分、多靶點、多途徑的作用特點，本實驗建立了HPLC梯度洗脫法同時測定金銀花及金芪降糖片中新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C，為進一步完善金芪降糖片的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Aglient 1200高效液相色譜儀（四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器，美國Aglient公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Sartorius LE225D型電子分析天平（德國Sartorius公司）。綠原酸（110753-200413）、咖啡酸（110885-200102）、木犀草苷（111520-200504）、蘆?。?00080-200707）、金絲桃苷（111521-200303）對照品購自于中國藥品生物制品檢定所。新綠原酸（X-014-110822）、隱綠原酸（Y-067-110825）、異綠原酸A（Y-068-120328）、異綠原酸C（Y-070-111128）對照品購自于成都瑞芬思生物科技有限公司。金銀花藥材由天津市中新藥業(yè)提供（批號120213、120214、10121402、11030202、11041101、11041803、Y1101021、Y1104107、Y1105175、Y1105181、Y1111245、Y1111247、Y1112292、Y1202036、Y1203053、Y1204032），經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為金銀花藥材Lonicerae Japonicae Flos。金芪降糖片為市售（批號0902417、0902422、0904435、0905459、0910498、0911475、0912506、1001514、1103628、1105655、1108683），缺金銀花陰性對照樣品（自制）。乙腈為色譜純（美國Sigmaaldrich公司）；水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

2 實驗方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Waters SymmetryShieldTMRP18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為：乙腈（A）-水（0.1%磷酸）（B），線性梯度洗脫程序為0～5 min，10%～13%A；5～20 min，13%～15%A；20～30 min，15%～18%A；30～45 min，18%～20%A；45～52 min，20%～23%A；52～70 min，23%A，體積流量1.0 mL/min，檢測波長355 nm、330 nm，柱溫25℃，進樣體積20 μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取新綠原酸4.76 mg、隱綠原酸5.53 mg、綠原酸19.14 mg、咖啡酸4.51 mg、木犀草苷2.95 mg、蘆丁10.88 mg、金絲桃苷4.39mg、異綠原酸A11.16mg、異綠原酸C4.04mg，置10 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度得各標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別移取新綠原酸母液2.236 mL，隱綠原酸母液2.980 mL，綠原酸母液4.690 mL，咖啡酸母液0.660 mL，木犀草苷母液0.896 mL，蘆丁母液1.988 mL，金絲桃苷母液0.530 mL，異綠原酸A母液7.570 mL，異綠原酸C母液6.953 mL于同一50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C質(zhì)量濃度分別為 21.29、32.96、179.5、5.953、5.286、43.26、4.653、169.0、56.18 μg/mL的混合對照品貯備液，備用。按“2.1”項下色譜條件測定，其色譜圖見圖1。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 金銀花藥材提取液的制備 金銀花藥材60℃干燥2 h，粉碎，過60目篩，混合均勻，稱取樣品0.2 g，精密稱定，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇約49 mL，超聲提取1 h，冷卻至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液為供試液，按“2.1”項下色譜條件測定。其色譜圖見圖1，以新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C 9種成分的對照品確定色譜峰的歸屬，外標(biāo)一點法定量。

2.3.2 金芪降糖片提取液的制備 取同一批號的金芪降糖片20片，除去包衣，粉碎，過60目篩，混合均勻，稱取0.4 g，精密稱定，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇約49 mL，超聲提取1 h，冷卻至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液為供試液，按“2.1”項下色譜條件測定。其色譜圖見圖2，以新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C 9種成分的對照品確定色譜峰的歸屬，外標(biāo)一點法定量。

圖1 混和對照品（A）和金銀花（B）的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A)and Lonicerae Japonicae Flos(B)

圖2 金芪降糖片（C）及其陰性對照液（D）的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of Jinqi Jiangtang tablets(C) and negative sample(D)

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項下混合對照品溶液0.25、0.5、1、2、3、4、5、8、10mL，分別置于10mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）分別得到9種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表1），線性關(guān)系良好。

表1 各對照品的回歸方程Tab.1 Regression equations of each reference substance

2.5 精密度實驗

2.5.1 金銀花精密度實驗 精密稱取同一批金銀花粉末0.2 g，按“2.3.1”項下制備金銀花的提取液，并在“2.1”項下色譜條件，連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定峰面積，計算。新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸 C保留時間的 RSD分別為 0.10%、0.17%、0.28%、0.22%、0.18%、0.25%、0.16%、0.07%、0.09%，峰面積的 RSD分別為 0.92%、0.99%、0.67%、0.83%、1.08%、1.68%、0.98%、0.78%、0.41%。

2.5.2 金芪降糖片精密度實驗 精密稱取同一批金芪降糖片粉末0.4 g，按“2.3.1”項下制備金銀花的提取液，并在“2.1”項下色譜條件，連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定峰面積，計算。新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C保留時間的RSD分別為0.42%、0.48%、0.49%、0.27%、0.32%、0.34%、0.34%、0.27%、0.37%，峰面積的RSD分別為2.54%、1.16%、0.37%、1.38%、1.66%、2.43%、2.10%、0.20%、0.21%。

2.6 穩(wěn)定性實驗

2.6.1 金銀花穩(wěn)定性實驗 精密稱取同一批金銀花粉末0.2 g，按“2.3.1”項下制備金銀花的提取液，并在“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、16、24 h進樣，測定峰面積，計算。新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C保留時間的RSD分別為0.13%、0.22%、0.29%、0.19%、0.17%、0.23%、0.16%、0.08%、 0.09%，峰面積的RSD分別為1.34%、1.09%、0.83%、1.57%、0.89%、1.70%、1.05%、0.72%、0.35%。結(jié)果表明，金銀花藥材供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.2 金芪降糖片穩(wěn)定性實驗 精密稱取同一批金芪降糖片粉末0.4 g，按“2.3.2”項下制備金芪降糖片的提取液，并在“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、16、24 h進樣，測定峰面積，計算。新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C保留時間的RSD分別為0.39%、0.46%、0.47%、0.32%、0.42%、0.45%、0.44%、0.32%、0.44%，峰面積的RSD分別為2.62%、2.06%、0.47%、1.38%、1.69%、2.55%、2.36%、0.23%、0.22%。結(jié)果表明，金芪降糖片供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗

2.7.1 金銀花重復(fù)性實驗 精密稱取同一批次金銀花粉末6份，各0.2 g，按“2.3.1”項下制備金銀花的提取液，并在“2.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，計算。新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C保留時間的RSD分別為0.09%、0.16%、0.17%、0.12%、0.18%、0.17%、0.18%、0.08%、0.12%，峰面積的 RSD分別為 1.68%、1.44%、0.76%、1.99%、1.54%、1.43%、1.38%、1.24%、1.65%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.7.2 金芪降糖片重復(fù)性實驗 精密稱取同一批次金芪降糖片粉末6份，各0.4 g，按“2.3.2”項下制備金芪降糖片的提取液，并在“2.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，計算。新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C保留時間的RSD分別為0.28%、0.40%、0.43%、0.22%、0.22%、0.23%、0.22%、0.12%、0.20%，峰面積的RSD分別為2.84%、1.91%、1.31%、2.07%、1.40%、2.99%、2.43%、2.21%、2.26%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率

2.8.1 金銀花加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的金銀花粉末9份，各0.1 g，加入各對照品的量相當(dāng)于金銀花中各對照品量的80%、100%、120%。按“2.3.1”項下制備金銀花的提取液，并在“2.1”項下色譜條件進行測定，以外標(biāo)法計算各成分的含量，計算回收率，結(jié)果新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸 C的平均回收率分別為 98.49%、99.6%、101.25%、100.43%、101.05%、99.49%、97.30%、98.71%、98.94%，RSD分別為1.98%、2.23%、2.66%、2.01%、2.41%、2.42%、1.99%、1.43%、3.15%。

2.8.2 金芪降糖片加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的金芪降糖片粉末9份，每份0.2 g，加入各對照品的量相當(dāng)于金芪降糖片中各對照品量的80%、100%、120%。按“2.3.2”項下制備金芪降糖片的提取液，并在“2.1”項下色譜條件進行測定，以外標(biāo)法計算各成分的含量，計算回收率，結(jié)果新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸A、異綠原酸C的平均回收率分別為99.50%、101.70%、98.56%、99.97%、100.00%、100.55%、99.65%、98.33%、102.75%，RSD分別為2.29%、3.51%、2.72%、2.73%、2.94%、2.23%、2.51%、1.80%、0.85%。

2.9 陰性對照液 取除金銀花以外的各原藥材，按“2.3.2”項下方法制備金芪降糖片的陰性對照液，并在“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，本實驗條件下，金芪降糖片中的黃芪、黃連對實驗結(jié)果沒有影響。

2.10 樣品的含量測定

2.10.1 金銀花藥材的含量測定 精密稱取不同批次金銀花粉末各0.2 g，按“2.3.1”項下制備金銀花提取液，并在“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果見表2。

2.10.2 金芪降糖片的含量測定 精密稱取不同批次金芪降糖片粉末0.4 g，按“2.3.2”項下制備金芪降糖片提取液，并在“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 通過三維圖譜提取9種成分的光譜，表明綠原酸在242 nm、305 nm及327 nm附近有最大吸收，新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C均在242 nm、298 nm及327 nm附近有最大吸收，咖啡酸在238 nm及322 nm下有最大吸收，木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷在254nm及354nm附近有最大吸收，同時在327 nm處的吸收也較大。綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C在354 nm處也有吸收，但其在354 nm處的吸收明顯低于327 nm處的吸收。為了能簡便、快速地檢測各化合物的含量，綜合考慮各被測成分的吸收波長，最終選定檢測波長為327 nm。

表2 金銀花藥材測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Determination of Lonicerae Japonicae Flos（n=3）mg/g

表3 金芪降糖片含量測定結(jié)果（n=3）Tab.3 Determination of Jinqi Jiangtang tablets（n=3） mg/片

3.2 流動相的選擇 由于金銀花成分復(fù)雜，單一流動相無法達到很好的分離效果，而采用梯度洗脫可以在整個分析時間段內(nèi)，各色譜峰達到很好的分離效果且相對保留時間穩(wěn)定。孫玉剛等[13-14]同時測定綠原酸及隱綠原酸的含量采用乙腈-0.1%甲酸為流動相。本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液。綜合考慮各被測成分的分離度及峰型，最終確定選用乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，各被測成分均能達到基線分離。

3.3 穩(wěn)定性的控制 實驗中發(fā)現(xiàn)，新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C對照品溶液、金銀花藥材提取液、金芪降糖片提取液穩(wěn)定性較差，溫度過高或放置時間較長易分解，各被測成分會分解，使各被測成分的含量發(fā)生變化，因此在配制相關(guān)對照品及供試品時，選用棕色容量瓶，避免光照，并在配制后保存于低溫條件下。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:205-206.

[2]劉 雄,高建德.金銀花質(zhì)量控制、化學(xué)成分及藥理學(xué)研究進展[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2006,23(4):46-49.

[3]趙國玲,劉佳佳.金銀花化學(xué)成分及藥理研究進展[J].中藥材, 2002,25(10):762-763.

[4] 趙良忠,蔣賢育,段林東,等.金銀花水溶性抗菌物質(zhì)的提取及其抑菌效果研究[J].中國生物制品學(xué)雜志,2006,19(2):201-203.

[5]黃喜茹,劉偉娜,曹 冬.金銀花的化學(xué)成分藥理作用研究評析[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2005,23(3):418-419.

[6]何顯忠,蘭榮德.金銀花的藥理作用與臨床應(yīng)用[J].時珍國醫(yī)國藥,2004,15(12):865-867.

[7] 劉祥蘭,劉重芳,張 英,等.金銀花中綠原酸提取工藝的比較和優(yōu)化研究[J].中成藥,2000,22(6):402-404.

[8] Abraham SK,Saltila L,Desavan PC.Protective effects of chlorogenic acid,curcuimin and a α-carotene against radiation induced in rico chromosomal damaged[J].MutationResearch,1993,303(3):109-112.

[9]黃麗瑛,呂植楨,李繼彪,等.中藥金銀花化學(xué)成分的研究[J].中草藥,1996,27(11):645-647.

[10]高玉敏,王名洲,王建平.金銀花化學(xué)成分的研究[J].中草藥, 1995,26(11):568-569.

[11]張元元,李 進,陳 濤,等.高效液相色譜法同時測定金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,30 (2):107-109.

[12]于 靜,鄧雁如,陳 奇,等.HPLC測定金銀花及金芪降糖片中6種成分的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(19):57-60.

[13]孫玉剛,秦續(xù)文,張 玲,等.高效液相色譜法同時測定青蒿綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內(nèi)酯含量[J].天津中醫(yī)藥,2012,29(5): 484-486.

[14]邢麗紅,李文龍,瞿海斌.金銀花提取物中5種有機酸含量測定的紫外光譜法[J].藥物分析雜志,2011,31(3):547-551.

Simultaneous determination of nine components in Lonicerae Japonicae Flos and Jinqi Jiangtang tablet by HPLC

CHEN Fang,DENG Yan-ru,GUO Li-ping
（Tianjin Key Laboratory of Chinese Medicine Chemistry and Analysis,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To develop a HPLC method for simultaneous determination of neochlorogenic acid,cryptochlorogenic acid, chlorogenic acid,caffeic acid,cynaroside,rutin,hyperoside,isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C in Lonicerae Japonicae Flos and Jinqi Jiangtang tablet.[Methods]The chromatographic conditions were follows:Waters Symmetry Shield TM RP18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm),acetonitrile(A)and water(0.1%phosphoric acid,B)as mobile phases for gradient elution,0～5 min，10%～13%A,5～20 min,13%～15%A；20～30 min，15%～18%A；30～45 min，18%～20%A；45～52 min，20%～23%A；52～70 min，23%A;the flow rate being 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 327 nm and the column temperature was 25℃.[Results]The results showed that nine components were well separated and showed good linearity.The average recoveries were between 95%～105%.[Conclusion]This is a specific,sensitive,repeatable and simple method for simultaneous determining neochlorogenic acid,cryptochlorogenic acid,chlorogenic acid,caffeic acid,cynaroside,rutin,hyperoside,isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C in Lonicerae Japonicae Flos and Jinqi Jiangtang tablet.The method can be available for the quality control of Jinqi Jiangtang tablet.

Jinqi Jiangtang tablet;Lonicerae Japonicae Flos;HPLC;neochlorogenic acid;cryptochlorogenic acid;isochlorogenic acid A

R285.5

：A

：1672-1519（2014）03-0168-05

2013-09-24）

（本文編輯：高 杉，馬曉輝）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.03.14

國家自然科學(xué)基金項目（81073033），國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目（2009CB523003）。

陳 芳（1986-），女，在讀碩士研究生，研究方向為藥物分析。

鄧雁如，E-mail:dyanru@sina.com。