董玢 張弛 劉涓 柴立民

（1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學教育部和北京市重點實驗室，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

補腎生血解毒方對再生障礙性貧血小鼠白細胞生成的影響

董玢1張弛2劉涓1柴立民1

（1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學教育部和北京市重點實驗室，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

目的：探討補腎生血解毒方對理化因素致骨髓抑制造成再生障礙性貧血（AA）模型小鼠白細胞生成的影響。方法：BALB/C小鼠隨機分為空白組、模型組和補腎生血解毒方小、中、大劑量組，除空白組以外其余各組小鼠以60Co-γ射線復合環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓造血抑制，補腎生血解毒方小、中、大劑量組分別給予不同劑量中藥灌胃，其余2組予等量生理鹽水灌胃。血細胞計數(shù)儀檢測小鼠外周血中白細胞（WBC）的改變，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測外周血血清中粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）含量的差異，real-time PCR檢測骨髓細胞中GM-CSF受體α、β基因表達的改變。結果：與模型組比較，補腎生血解毒方可以明顯提高AA模型小鼠外周血白細胞數(shù)量（小劑量作用14d），顯著增加外周血血清中GM-CSF含量和骨髓細胞中GM-CSF受體基因的表達。結論：補腎生血解毒方治療AA發(fā)揮療效作用，可能與提高GM-CSF活性和誘導造血細胞分化為成熟的白細胞，并促進其增殖、發(fā)揮免疫調節(jié)作用有關。

再生障礙性貧血 補腎生血解毒方 白細胞 粒細胞-巨噬細胞 骨髓細胞 實驗研究

再生障礙性貧血（aplastic anermia，AA）是由于化學、物理、生物因素及不明原因引起的骨髓造血功能衰竭，紅骨髓總容量減少，代以脂肪髓，骨髓中無惡性腫瘤浸潤，以全血細胞減少為主要表現(xiàn)的一組綜合征，臨床上常表現(xiàn)為較為嚴重的貧血、出血和感染[1]。我們以當歸補血湯和龜鹿二仙膠化裁創(chuàng)立補腎生血解毒方，用于臨床治療急慢性AA，取得了良好的治療效果。為進一步研究補腎生血解毒方治療AA的作用機制，我們以理化因素致骨髓抑制造成AA小鼠模型，予補腎生血解毒方干預，觀察該方對AA小鼠外周血白細胞（White blood cell，WBC）生成的影響，以及血清中粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）含量和GMCSF受體（GM-CSF receptor，GM-CSF1R）α、β基因表達的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物BALB/C近交系小鼠50只，雄性，體重（20±2）g，8～12周齡，動物質量合格證明編號：0269024，飼養(yǎng)于東直門醫(yī)院屏障級實驗動物中心。

1.2 藥物與試劑環(huán)磷酰胺購自山西普德藥業(yè)股份有限公司；補腎生血解毒方，處方：龜版膠、鹿角膠、人參、枸杞子、黃芪、當歸、黃連（1∶2∶3∶4∶6∶1∶1），由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院藥劑科提供；GM-CSF酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）kit購自武漢博士德生物有限責任公司，SYBR Green PCR Master Mix購自美國Life Technologies公司。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及藥物干預將小鼠隨機分為5組，分別為空白組、模型組和補腎生血解毒方小、中、大劑量組，每組10只。除空白組以外，其余各組小鼠一次全身2.5Gy60Co-γ射線照射（劑量率1.1053Gy/min，距離240cm，時間135s），空白組小鼠假照射（鉛磚屏蔽）。分別于照射后第4、5、6天腹腔注射環(huán)磷酰胺40mg/kg[2]，空白組小鼠注射等容量生理鹽水。造模結束后第1天開始藥物干預，補腎生血解毒方小、中、大劑量組按成人劑量的5、10、20倍計算，分別灌胃給予補腎生血解毒方6.14、12.29、24.57g/（kg·d），模型組和空白組分別給予等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃13d。

2.2 外周血WBC數(shù)量檢測分別于造模結束后0、7、14d，小鼠尾靜脈取血，血細胞計數(shù)儀檢測外周血中WBC數(shù)量。

2.3 外周血血清及骨髓細胞樣品制備藥物干預結束后，小鼠摘眼球取血，室溫放置1h后，2500r/min離心15min，分離血清，-20℃儲存?zhèn)銭LISA檢測。分離小鼠股骨，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗骨髓細胞至平皿中，離心收集細胞，PBS重懸成單細胞懸液，細胞濃度為1×107/mL，備real-time PCR檢測。

2.4 EILSA檢測血清中GM-CSF的含量取小鼠外周血血清，嚴格按照ELISA kit說明操作，檢測小鼠外周血血清中GM-CSF的含量。

2.5 Real-time PCR檢測骨髓細胞中GM-CSF1Rα、β基因的表達Trizol一步法提取骨髓細胞總RNA，經(jīng)反轉錄成cDNA，設計看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和GM-CSFRα、β特異性PCR引物，real-timePCR檢測小鼠骨髓細胞中GMCSFRα、β基因表達的改變。取一樣品cDNA作為相對標準品，倍比稀釋，以GAPDH為擴增引物，與目的基因在同一程序中擴增，繪制標準曲線，通過熒光檢測閾值讀取目的基因的相對拷貝數(shù)，計算其與GAPDH基因拷貝數(shù)的比值，以消除實驗誤差。PCR引物序列——GAPDH：sense，5'-CAGCAAG GACACTGAGCAAGA；antisense，5'-GCCCCTCCTGTTATTATG GGG。GM-CSFRα：sense，5'-TGAAGCGATGCTGATAGACG；antisense，5'-TCCAGGGTGATTGACAGGAT。GM-CSFRβ：sense，5'-AAAGTGCCAAAATGGACCAG；antisense，5'-AGCTGCAGA TGATGTGGTTG。由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

2.6 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，結果采用（±s）表示，通過統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)做正態(tài)性和方差齊性檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用LSD法或Tamhane法。P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有極顯著性。

3 實驗結果

3.1 補腎生血解毒方對AA小鼠外周血中白細胞數(shù)量的影響見表1。與空白組比較，其余各組小鼠在造模完成后外周血中WBC（即粒細胞、單核細胞和淋巴細胞）數(shù)量均明顯下降（P＜0.01）。予中藥或生理鹽水灌胃7d后，模型組和補腎生血解毒方各劑量組小鼠WBC無明顯上升趨勢；14d后，與模型組比較，補腎生血解毒方各劑量組外周血WBC均呈現(xiàn)升高趨勢，其中補腎生血解毒方小劑量組WBC升高較為明顯（P＜0.05）。

表1 補腎生血解毒方對AA小鼠外周血白細胞數(shù)量的影響（±s，g/L）

表1 補腎生血解毒方對AA小鼠外周血白細胞數(shù)量的影響（±s，g/L）

注：△△與空白組比較，P＜0.01；*與模型組比較，P＜0.05。

組別動物數(shù)造模后天數(shù)14d 0.59±0.20△△0.48±0.23△△補腎生血解毒方小劑量組100.46±0.19△△0.50±0.24△△3.32±0.32△△*補腎生血解毒方中劑量組100.46±0.27△△0.36±0.23△△2.60±0.38△△補腎生血解毒方大劑量組100.48±0.17△△0.68±0.32△△2.64±0.57△△0d7d空白組104.74±1.243.95±1.065.09±0.88模型組102.41±0.93△△

3.2 補腎生血解毒方對AA小鼠外周血血清中GM-CSF和骨髓細胞GM-CSF受體基因表達的影響見表2。與模型組和空白組相比，補腎生血解毒方各劑量組小鼠血清中GMCSF顯著升高（P＜0.01），模型組與空白組相比GM-CSF含量無顯著性差異；與模型組比較，補腎生血解毒方各劑量組骨髓細胞中GM-CSFRα基因表達明顯升高（P＜0.01）；而GMCSFRβ基因表達僅補腎生血解毒方大劑量組與模型組和空白組相比有極顯著性差異（P＜0.01）。

表2 各組小鼠血清中GM-CSF含量和骨髓細胞中GM-CSFRα、β基因表達的差異（±s）

表2 各組小鼠血清中GM-CSF含量和骨髓細胞中GM-CSFRα、β基因表達的差異（±s）

注：**與模型組比較，P＜0.01；△△與空白組比較，P＜0.01。

組別動物數(shù)GM-CSF含量（pg/mL）GM-CSFRα/GAPDH基因表達相對拷貝數(shù)比值GM-CSFRβ/GAPDH基因表達相對拷貝數(shù)比值空白組1079.717±10.8010.875±0.5121.096±0.489模型組1072.841±11.1990.318±0.2420.530±0.302中藥小劑量組10129.120±32.211**△△0.930±0.292**0.720±0.399中藥中劑量組10152.559±25.236**△△0.966±0.379**1.302±0.793中藥大劑量組10150.476±24.892**△△1.134±0.540**2.795±1.063**△△

4 討論

根據(jù)AA的中醫(yī)證候特點，外邪和內(nèi)傷等多種致病因素導致氣血虧虛，傷及肝脾腎諸臟，氣血不足，髓脈空虛，內(nèi)生毒邪留滯彌散，耗損髓脈，精不化血，出現(xiàn)血虛的證候。氣血精津虧損，毒邪內(nèi)生，髓脈受損，血脈空虛，氣血凝滯，內(nèi)毒進一步損傷血脈，形成循環(huán)往復的病理損傷。AA病位在肝脾腎，髓脈損傷之本虛為主，內(nèi)毒侵蝕之標實為輔。在治療上應以填補腎精為主，輔以益氣生血解毒。龜鹿二仙膠具有填補精血、益氣壯陽的功效，用于本方取其補腎填精；當歸補血湯是金元時期李東垣創(chuàng)制的“補氣生血”經(jīng)典名方，配以黃連，奏“補氣生血解毒”之功。諸藥協(xié)同，補腎填精、生血解毒，達到治療AA的目的。

GM-CSF是一種調節(jié)造血細胞增殖和分化的細胞因子，是分子量為22kD的糖蛋白。GM-CSF與GM-CSFR結合后促進多種造血細胞的存活、增殖、分化，并通過提高中性粒細胞、單核細胞、樹突狀細胞等的數(shù)量發(fā)揮免疫調節(jié)作用[3]。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，隨著GM-CSF濃度的增加，首先單核巨噬細胞增殖，隨后是中性粒細胞，最后是嗜酸性粒細胞和巨噬細胞。此外GM-CSF還能刺激多能干細胞和早期紅細胞的增殖和分化[4-6]。GM-CSFR由α、β兩個受體組成，都屬于I型細胞因子超家族成員。α受體可與GM-CSF發(fā)生特異性結合，但親和力較低；單獨β受體不能與GM-CSF結合，但與α受體結合可形成高親和力的聚合體。GM-CSF與受體結合后引起αβ受體二聚化和四聚化，活化絡氨酸激酶，受體本身磷酸化，動員SH2和PTR結構域的蛋白到受體，傳遞刺激信號，誘發(fā)促進造血干細胞向WBC轉化，促進WBC增殖[7]。

AA是因多重因素所致的骨髓造血功能衰竭，是以造血干細胞數(shù)量減少或質的缺陷為主導致的造血障礙，臨床上以全血細胞減少為主要表現(xiàn)。重型AA成熟的治療措施是免疫抑制治療和造血干細胞移植。當缺乏組織相容性同源供體、患者年齡或無法負擔高額的干細胞移植成本等情況出現(xiàn)時，免疫抑制治療就成為首選的AA治療措施[8]。中醫(yī)藥治療的多層次、多靶點的整體治療模式，是造血干細胞移植和免疫抑制治療的有效補充治療模式。我們的前期實驗研究證實，補腎生血解毒方通過刺激干細胞因子的表達，誘導造血干細胞的增殖[9]。為進一步探討補腎生血解毒方治療AA的作用靶點，我們對該方促進外周血白細胞生成的機制進行了深入研究。本實驗結果顯示：補腎生血解毒方可以明顯升高AA小鼠外周血中WBC的數(shù)量；ELISA檢測顯示，該方可以明顯增加AA小鼠外周血中GM-CSF的含量，對GM-CSFR基因的表達亦有顯著的刺激作用。由此我們認為，補腎生血解毒方可以通過GM-CSF/GM-CSFR信號途徑，調節(jié)造血細胞的增殖和分化，促進外周血中白細胞的生成，恢復體內(nèi)免疫調節(jié)的穩(wěn)態(tài)，來達到治療的目的。這可能是補腎生血解毒方治療再生障礙性貧血的關鍵作用機制之一。

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R556.505

A

1672-397X（2014）01-0077-03

董玢（1963-），女，大專學歷，主管技師，主要從事免疫學基礎與臨床檢測。

柴立民，liminchai@hotmail.com

2013-07-20

編輯：吳寧

國家自然科學基金資助項目（81373583）