白紅梅 張杰 陳璐

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029）

電針對大鼠腎缺血再灌注損傷的療效及對腎組織中caspase-3表達(dá)的影響

白紅梅 張杰 陳璐

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029）

目的：探討電針治療對腎缺血再灌注大鼠腎功能及組織中Caspase-3表達(dá)的影響。方法：將30只清潔級健康SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組、缺血再灌注組（IRI組）和電針組，每組10只。采用右腎摘除，左腎腎蒂夾閉缺血45min后再灌注的方法制備動物模型。電針組于造模成功后給予電針腎俞和涌泉穴治療。各組均于術(shù)后24h采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮（BUN）和肌酐（Scr），觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)改變，TUNEL法檢測腎組織細(xì)胞凋亡率和免疫組化檢測腎組織細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果：腎缺血再灌注后大鼠血清BUN和Scr明顯升高，腎組織切片顯示有明顯的病理改變，腎組織細(xì)胞凋亡率及Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)顯著升高。與缺血再灌注組比較，電針組大鼠BUN和Scr顯著下降，腎組織細(xì)胞凋亡率顯著降低，Caspase-3陽性細(xì)胞的IOD值顯著降低。結(jié)論：電針對IRI所致腎功能損害具有顯著的保護(hù)作用，能夠抑制Caspase-3蛋白表達(dá)，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，該作用可能是電針對IRI后腎臟保護(hù)作用的重要機制之一。

腎缺血再灌注損傷 電針 細(xì)胞凋亡 caspase-3表達(dá) 病理學(xué) 實驗研究

缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指缺血組織在重新獲得血供后，組織細(xì)胞損傷未見減輕反而加重的一種病理生理現(xiàn)象。研究表明，IRI可通過炎癥、活性氧、內(nèi)皮素和細(xì)胞凋亡等多種途徑導(dǎo)致腎損害，而細(xì)胞凋亡是缺血再灌注致腎損傷的重要環(huán)節(jié)之一。因此，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對IRI的防治具有重要的臨床意義。目前認(rèn)為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）依賴的細(xì)胞凋亡途徑在IRI誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮主要作用[1]。近年有研究表明，電針治療可下調(diào)Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)，進(jìn)而可抑制細(xì)胞凋亡[2]。針刺耳穴可以減少血管癡呆大鼠海馬齒狀回Caspase-3表達(dá)，減少腦缺血缺氧所致的海馬齒狀回顆粒細(xì)胞死亡[3]。本研究旨在評價電針對缺血再灌注損傷腎臟的保護(hù)作用和對IRI誘導(dǎo)的腎組織細(xì)胞Caspase-3活性表達(dá)、細(xì)胞凋亡等的影響以探討電針對缺血再灌注損傷腎臟的保護(hù)機制及臨床應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗分組與模型制作將30只清潔級健康SD雄性大鼠（體重180～200g，江蘇省中醫(yī)院藥理實驗室提供）隨機分為假手術(shù)組、缺血再灌注組（IRI組）和電針組，每組10只。參照文獻(xiàn)[4]的方法建立腎缺血再灌注損傷模型，方法如下：采用3.5%水合氯醛1mL/100g腹腔麻醉后，腹橫切口入腹腔，切除右腎，顯露左腎蒂，用無創(chuàng)傷血管夾夾閉左腎蒂45min，造成腎缺血，然后松開血管夾行再灌注。松開血管夾，數(shù)分鐘內(nèi)腎臟顏色由缺血時的暗紅色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈t色，表示腎缺血再灌注模型建立成功。IRI組與電針組大鼠上法造模，假手術(shù)組做常規(guī)暴露左腎手術(shù)，不夾閉左腎蒂，45min后關(guān)腹。

1.2 電針治療方法參照第4版《實驗針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜，選取腎俞和涌泉穴，常規(guī)消毒后，用直徑為0.22mm，長13mm的毫針，刺入3mm左右，接通華佗牌SD-I型電子針療儀，留針30min，采用連續(xù)波，頻率為3Hz，強度以大鼠尾巴輕微顫動為度。

1.3 檢測指標(biāo)及檢測方法

1.3.1 血清尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）各組大鼠術(shù)后24h經(jīng)下腔靜脈取血2～3mL，檢測血清尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）。

1.3.2 腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察取左腎中間部位0.5cm× 1cm大小，固定，脫水，包埋，5μm厚度切片，HE染色，400倍光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)的改變。

1.3.3 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記法（TUNEL）測定細(xì)胞凋亡率腎組織標(biāo)本常規(guī)處理，切片，TUNEL染色，鏡下細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性凋亡細(xì)胞。高倍鏡下觀察，對8個連續(xù)不重疊的視野中陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.3.4 免疫組化檢測Caspase-3的表達(dá)光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)情況，每張切片隨機采集5個高倍視野（400×），采用美國Media Cybernetics公司專業(yè)圖片分析軟件Image-Pro Plus，檢測Caspase-3表達(dá)的平均光密度值（IOD），所有視野均在同一光強度下檢測。

2 實驗結(jié)果

2.1 腎功能指標(biāo)檢測結(jié)果與假手術(shù)組比較，IRI組和電針組大鼠BUN和Scr明顯升高（P＜0.01）；與IRI組比較，電針組大鼠BUN和肌酐Scr顯著下降（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清中BUN和Scr含量（±s）

表1 各組大鼠血清中BUN和Scr含量（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與IRI組比較，#P＜0.01。

組別動物數(shù)BUN（mmol/L）假手術(shù)組Scr（μmol/L）1011.14±2.5536.1±3.1 1032.30±3.62*電針組1022.18±3.02*#62.3±3.1*#IRI組109.4±8.6*

2.2 腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察腎組織切片光鏡下顯示假手術(shù)組腎管細(xì)胞大致正常；IRI組大部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)不同程度的變性與壞死，間質(zhì)有充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤；電針組腎小管病變減輕較為明顯，僅見部分腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹，少量變性與壞死，腎間質(zhì)無明顯改變及炎細(xì)胞浸潤（見圖1）。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理圖片（×400）

2.3 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果TUNEL陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈黃褐色，細(xì)胞質(zhì)無染色，位于腎小管上皮細(xì)胞，腎小球無表達(dá)（見圖2）。圖像分析后，結(jié)果見表2。缺血再灌注損傷后，與假手術(shù)組比較，IRI組和電針組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與IRI組比較，電針組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡情況（×400）

2.4 Caspase-3蛋白表達(dá)檢測結(jié)果Caspase-3陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，細(xì)胞核無著色，圖中細(xì)胞核呈深藍(lán)色系蘇木素復(fù)染的結(jié)果（見圖3）。圖像分析后，結(jié)果見表2。與假手術(shù)組比較，IRI組和電針組大鼠Caspase-3表達(dá)IOD值顯著升高（P＜0.01）；與IRI組比較，電針組大鼠Caspase-3表達(dá)IOD值顯著降低（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞Caspase-3表達(dá)圖（×400）

表2 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率和Caspase-3表達(dá)IOD值比較（±s）

表2 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率和Caspase-3表達(dá)IOD值比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與IRI組比較，#P＜0.01。

組別動物數(shù)凋亡率（%）假手術(shù)組IOD 103.98±1.472001±606 1051.38±7.92*電針組1028.39±7.80*#3538±840*#IRI組7681±870*

3 討論

腎臟為高灌注器官，對缺血及缺血后再灌注均較敏感，因此在腎移植、腎血管手術(shù)、體外碎石、休克復(fù)蘇后很容易發(fā)生腎臟缺血再灌注，是缺血性急性腎衰竭（acute renal failure，ARF）的重要損傷環(huán)節(jié)，也是移植腎功能延遲恢復(fù)與慢性移植腎喪失功能的關(guān)鍵因素之一[5-6]。缺血如果能夠及時糾正，并且能夠盡可能避免或減少再灌注性損傷，腎功能可不受影響或很快恢復(fù)正常，但當(dāng)腎臟局部缺血不能在機體自身神經(jīng)體液等因素的調(diào)節(jié)下進(jìn)行有益的平衡時，該缺血和隨后的再灌注損傷可導(dǎo)致不正常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞功能的異常，引發(fā)一系列凋亡事件和壞死。細(xì)胞凋亡是缺血再灌注組織和器官損傷的重要途徑[7]，而Caspase-3位于細(xì)胞凋亡的下游，是各種凋亡通路的必經(jīng)之路，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[8]。

經(jīng)絡(luò)學(xué)說研究人體經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的循環(huán)分布、生理功能、病理變化及其與臟腑相互關(guān)系，是中國古代醫(yī)學(xué)家們在長期實踐中，經(jīng)過對“針感”的傳導(dǎo)、俞穴療效的體表病理現(xiàn)象的推測與了解，生理知識總結(jié)而啟發(fā)創(chuàng)立出來的?！澳I俞”為腎的背俞穴，為腎臟氣輸注于背部的腧穴，具有補益腎氣的作用；“涌泉”穴為腎經(jīng)的井穴，具有益腎、滋陰的作用。二穴在臨床上為治療腎臟及相關(guān)疾病的常用穴，具有較好的臨床療效。有研究表明，電針“腎俞”穴可升高腎血流量[9]。

本研究采用電針“腎俞”、“涌泉”兩穴治療缺血再灌注致腎損傷大鼠，結(jié)果表明經(jīng)電針組大鼠血清BUN和Scr顯著下降，腎組織細(xì)胞凋亡率顯著降低，Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)的IOD值顯著降低，提示電針對IRI所致腎功能損害具有顯著的保護(hù)作用，其深入機制有待進(jìn)一步探討。

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編輯：吳寧

R245.97

A

1672-397X（2014）01-0073-02

白紅梅（1965-），女，醫(yī)學(xué)士，主任醫(yī)師，麻醉學(xué)專業(yè)。1007gh@163.com

2013-04-08