黃有松，徐東暉，2，陳洪舉，3，張 寰，4，林森杰，劉光興，3＊＊

（中國海洋大學(xué)1.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院；2.海洋環(huán)境學(xué)院；3.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島266100；4.Department of Marine Sciences，University of Connecticut，Groton，CT 06340，USA；5.廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點實驗室，海洋生物多樣性與全球變化實驗室，福建 廈門361005）

作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的后生動物以及浮游植物等的主要攝食者，橈足類在海洋食物網(wǎng)中具有重要的生態(tài)意義，其攝食對海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動具有重要影響[1－2]。準(zhǔn)確測定自然海區(qū)中橈足類的食物組成及攝食率等是定量理解它們與其它海洋生物之間的營養(yǎng)關(guān)系、有害藻華的生消、水體中有機物的垂直通量以及近海碳循環(huán)等過程的關(guān)鍵，也是建立可靠生態(tài)動力學(xué)模型，提供準(zhǔn)確海洋漁業(yè)預(yù)測的重要步驟[3]。

中華哲水蚤（Calanussinicus）廣泛分布于西北太平洋陸架海區(qū)，是該水域的特征性橈足類[4]，同時，也是我國渤、黃、東海等近岸水域浮游動物的優(yōu)勢種和關(guān)鍵種[5－11]。有關(guān)中華哲水蚤的食物組成已有諸多報道[12－19]，這些關(guān)于中華哲水蚤攝食的研究主要使用培養(yǎng)法、基于色素測定和鏡檢鑒定的腸道內(nèi)含物分析法以及脂肪酸標(biāo)記物法等，由于種種局限（培養(yǎng)法脫離現(xiàn)場水體環(huán)境，受到瓶頸效應(yīng)影響；色素測定受限于色素降解，且只能檢測有色素食物；顯微鏡檢法需要專門的形態(tài)分類知識，費時耗力，準(zhǔn)確性受樣品形態(tài)影響很大；脂肪酸法受限于其表征食物種類時的不穩(wěn)定性等）[20－21]，所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度離得知橈足類的現(xiàn)場（insitu）攝食食性還相差較遠。

分子生物學(xué)技術(shù)在研究攝食[22－23]及寄生[24]等營養(yǎng)關(guān)系中具有明顯的優(yōu)勢，可避開許多其它方法的缺點和局限。近些年來，已有學(xué)者開始探索將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于橈足類的攝食習(xí)性分析中[20]，并且通過一系列的實驗證明了分子生物學(xué)方法是研究橈足類攝食和水域食物網(wǎng)營養(yǎng)物質(zhì)傳遞的有效手段[25－26]。本文使用PCR的分子生物學(xué)技術(shù)，以核糖體小亞基基因（18S rDNA）為目標(biāo)序列，通過非橈足類（non－copepod）引物的運用，研究了黃河口鄰近水域中華哲水蚤的現(xiàn)場食物組成。本研究期望通過優(yōu)化橈足類攝食的分子生物學(xué)研究方法，為分析橈足類的現(xiàn)場食性提供新的認識，并為深入理解橈足類在海洋食物網(wǎng)中的作用提供方法支持和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及現(xiàn)場處理

浮游動物樣品于2011年5月在黃河口鄰近水域（37°58′30.20″N，119°33′37.70″E，水深16m）采用淺水Ⅰ型浮游生物網(wǎng)（網(wǎng)口直徑為50cm，篩絹孔徑為0.505 mm）進行垂直拖網(wǎng)采得。為避免拖網(wǎng)時間過長以及拖網(wǎng)速度過快可能造成的誤差（時間過長可能會使高密度的目標(biāo)橈足類在網(wǎng)底管處存在非自然狀態(tài)下的攝食行為，拖網(wǎng)速度過快可能會刺激橈足類排便）[27]，拖網(wǎng)速度控制在0.5m/s左右。樣品采集后立即使用中性魯哥氏液（Uterm9hl’s solution）[28]固定，并保持魯哥氏液的終濃度為2%。

1.2 中華哲水蚤的室內(nèi)處理

現(xiàn)場固定的浮游動物樣品帶回實驗室后，在體視顯微鏡（Lecia，S8APO）下將中華哲水蚤個體挑出，并置于0.22μm濾膜過濾的現(xiàn)場海水中（加入中性魯哥氏液，使終濃度為2%）暫存。DNA提取前對樣品進行清洗、去除附肢、鏡檢等處理，以確保在清洗之后中華哲水蚤的體表沒有其它生物或者碎屑附著。中華哲水蚤個體在挑選、清洗和去除附肢等DNA提取前處理的過程中采用無菌技術(shù)和無菌操作。

1.3 總基因組DNA的提取

使用 Axygen研磨棒（Fisher Scientific）對樣品進行充分研磨。待樣品研磨至勻漿后加入400μL DNA提取緩沖液[29]（1%SDS，100mmol·L－1EDTA pH 8.0和200μg·mL－1蛋白酶K），55℃溫育2d進行細胞裂解，使用CTAB方法進行基因組DNA（以下簡稱DNA）的提取，最終將所獲取的DNA溶解在20～50μL 10mmol/L Tris－Cl（pH 8.0）中，并按照Zhang等報道的方法對提取的DNA進行純化[29]，獲取的DNA提取儲存于－20℃。

1.4 PCR擴增與基因克隆

為了得到橈足類以外的盡可能多的其它真核生物（潛在食物）類群的序列，本實驗使用18Snon－copepod引物（18Snon－copepod F2 和 non－copepod R2）（見表1）對提取的DNA進行PCR擴增。25μL反應(yīng)體系包含2.5μL 10× PCR Buffer（含 Mg2＋），2μL 20mmol/L的dNTPs，5μmol/L的正反向引物各0.5，0.2μL的ExTaq酶（Takara），1μL的DNA模板。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性60s；94℃變性30s，68℃退火和延伸70s，10個循環(huán)；94℃變性15s，58℃退火30s，72℃延伸40s，25個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

表1 本研究中所使用的引物序列Table 1 Information of primer sequences used in this study

另外，使用真核生物通用引物18ScomF1和comR1（見表1）對中華哲水蚤基因組DNA進行擴增，獲取中華哲水蚤18SrDNA序列，擴增條件為94℃預(yù)變性1min；95℃變性20s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物使用 Agarose Gel DNA Purification Kit v2.0（Takara）進行純化?；厥蘸筮M行PCR產(chǎn)物末端加A、連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、藍白斑篩選、質(zhì)粒DNA提取與酶切等一系列基因克隆過程，具體方法與步驟參見[30]。隨機挑選一定數(shù)目的陽性克隆進行序列測定。

1.5 序列比對和分析

對所獲原始序列進行手動檢查，并去掉載體和引物序列，得到引物真正擴增出的序列?；贐LAST[31]在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中尋找同源序列信息。使用Clustal X v2.1[32]將所匹配到的最相似序列（代表最佳匹配類群或種類）與實驗所獲取序列進行比對，然后使用 MEGA 5.0[33]構(gòu)建鄰接樹（Neighbor Joining tree，N－J tree）。所用核苷酸替代模型為 Kimura 2－parameter模型，Gamma值由jModelTest[34]計算獲得。自舉值（Bootstrap value）為1 000，其它參數(shù)設(shè)置均為默認值。

另外，基于NCBI的分類瀏覽器命名法（Taxonomy Browser nomenclature），以所獲取序列BLAST時匹配到的前幾條（一般為5條左右）序列為基準(zhǔn)，對每條BLAST時與GenBank數(shù)據(jù)庫中最佳匹配序列的相似性大于94%的序列推定了其所能確定到的最低分類階元。

2 研究結(jié)果

2.1 中華哲水蚤的分子生物學(xué)鑒定

對中華哲水蚤除進行形態(tài)鑒定以外，使用真核生物核糖體小亞基通用引物（18ScomF1和comR1）擴增其DNA。所得1.7kb序列與GenBank數(shù)據(jù)庫已登記的中華哲水蚤序列（GU969174）相似度達到99%～100%。這也從18SrDNA序列水平上證實了實驗所用目標(biāo)橈足類為中華哲水蚤。

2.2 中華哲水蚤食物18SrDNA序列的擴增

使用18Snon－copepod F2和non－copepod R2擴增中華哲水蚤現(xiàn)場樣品的總DNA中非中華哲水蚤來源的DNA（中華哲水蚤的食物等其它種類的DNA），所得基因序列豐富多樣，來源于不同生物類群（見表2），表明中華哲水蚤可能有著廣泛的食物譜。

基于18Snon－copepod引物擴增出的PCR克隆文庫共獲取32條序列，其中7條為中華哲水蚤來源。剩余的25條非中華哲水蚤來源的序列分屬于硅藻、甲藻、隱藻、綠藻、水螅水母類、櫛水母類、軟體動物和Ichthyosporea等8個門類。其中，水母類（櫛水母類、水螅水母類）占有顯著優(yōu)勢地位，各類群所占比例見圖1。

表2 2011年5月黃河口鄰近水域中華哲水蚤樣品中擴增出的潛在食物Table 2 Taxonomic distribution of potential diets retrieved frominsitufixed Calanussinicus sampled in Yellow River Estuary and adjacent waters in May，2011

圖1 用18Snon－copepod引物擴增中華哲水蚤樣品所得非中華哲水蚤來源序列中各生物類群及所占比例Fig.1 Lineages and corresponding proportions of non－Calanussinicus origin 18SrDNA sequences amplified frominsitufixed Calanussinicus

在檢測出的生物類群中，占最優(yōu)勢地位的是櫛水母類（32.0%）。8條櫛水母來源序列中有5條（YRE－I－15～19）序列可確定的最低分類階元為目，屬于櫛水母門Typhlocoela綱中的球櫛水母目（Cydippida）（相似度為98%～99%），從親緣關(guān)系可以看出（見圖2），這5條序列很可能來自同一個屬，甚至是同一種。其余3條櫛水母序列（YRE－I－12～14）與上述5條序列以及GenBank中的已知同源序列相似度較低。其中，序列YRE－I－14的最低分類階元可確定到球櫛水母目中的Mertensiidae科，YRE－I－13的最低分類階元到櫛水母門觸手綱（Tentaculata），進一步的分類階元不能確定，而序列YRE－I－12因與已知序列的相似度較低（90%），故未進行最低分類階元的推定（見表2）。具有第二優(yōu)勢的序列來源于水螅水母類，其中3條為水螅水母綱花水母（Anthomedusae）來源，另外2條來源于軟水母（Leptomedusae）。樣品中水母類（櫛水母類和水螅水母類）來源的序列所占比例達52.0%。

甲藻來源的5條序列處于第三優(yōu)勢地位，其中4條（YRE－I－07～10）很可能來源于寄生性的甲藻Syndiniales（見表2），系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示，它們以較高的自舉值（85）和已知的Syndiniales類群聚在一起。其中YRE－I－09與 YRE－I－10可確定的最低分類階元到Syndiniales中的Euduboscquella屬（這2條序列與Euduboscquellasp.JN934989 的相似度為 96%）。序列YRE－I－08因與已知序列的相似度較低（93%），故未進行可確定的最低分類階元的推定。序列YRE－I－07可確定的最低分類階元為Syndiniales中的另一個寄生性類群Ichthyodinium屬。第5條甲藻序列（YRE－I－06）可確定的最低分類階元為甲藻綱（Dinophyceae），可能來源于裸甲藻目（Gymnodiniales）中的裸甲藻科（Gymnodiniaceae）。

此外還檢測到硅藻的序列，占總非中華哲水蚤序列的12.0%，它們均來源于中心硅藻綱（Coscinodisco－phyceae）海鏈藻目（Thalassiosirales）海鏈藻科（Thalassiosiraceae）海鏈藻屬（Thalassiosira）。剩余4條序列中有2條分別隸屬于綠藻門（Chlorophyta）石莼綱（Ulvophyceae）石莼目（Ulvales）石莼科（Ulvaceae）石莼屬（Ulva）（與UlvarigidaAJ005414的相似度為99%）和軟體動物（與RissoellarissoaformisFJ917214的相似度為85%）。另外的2條序列分別來源于隱藻和Ichthyosporea，一種介于原生生物和真菌之間的寄生生物。

3 討論

浮游動物與其食物之間的營養(yǎng)關(guān)系是海洋生源要素循環(huán)的重要影響因子，理解這類營養(yǎng)關(guān)系有助于提高和完善對生態(tài)系統(tǒng)、氣候和漁業(yè)預(yù)測及管理模型等的認識[20]。在傳統(tǒng)測定方法（如解剖法和腸道色素分析法）受到局限時，分子生物學(xué)手段提供了一個能夠準(zhǔn)確認識浮游動物現(xiàn)場食物組成的新方法。

以往基于鏡檢法的中華哲水蚤攝食研究表明，渤海中華哲水蚤成體[13]和橈足幼體[14]的食物組成類似，均是以圓篩藻為代表的硅藻占絕對優(yōu)勢，推測中華哲水蚤為植食性橈足類，并且對圓篩藻表現(xiàn)出明顯的攝食選擇性。也有研究指出，廈門海域的中華哲水蚤也營植食性生活，以硅藻為主要食物，但是對餌料基本沒有選擇性攝食[12]。需要注意的是，基于鏡檢的腸道內(nèi)含物分析法常常會因為方法本身局限性（例如：圓篩藻具有厚硅質(zhì)外殼，不易消化，更容易殘留在消化道內(nèi)而被檢出，而甲藻等其它類群卻因為橈足類的消化產(chǎn)生出很多難以辨認的殘留，有些種類例如纖毛蟲等甚至沒有殘余留下）造成誤差。類似情況也發(fā)生在使用掃描電鏡分析中華哲水蚤食物的研究中。雖然通過可辨認的生物成分表明臺灣東北部海域中華哲水蚤的食物組成是以當(dāng)?shù)馗∮沃参镏械墓柙鍨橹?，但是有很大部分是不可辨認的食糜、海雪和浮游植物的殘留[18]。另外，Liu等基于脂肪酸組成研究了膠州灣中華哲水蚤的食物組成，認為中華哲水蚤除了浮游植物之外還可能攝食有機碎屑、細菌及小型橈足類等[19]。

與以往研究中中華哲水蚤攝食食物的種類和范圍相比，基于18Snon－copepod引物對黃河口鄰近水域中華哲水蚤食物的分子生物學(xué)分析檢測出屬于8個門的生物，揭示了多樣化的潛在食物類群（見圖2）。這一結(jié)果拓展了對于中華哲水蚤食物范圍的認識。同時，多樣化生物類群的檢出也顯示出分子生物學(xué)技術(shù)在橈足類攝食研究中的強大效用和優(yōu)勢。

3.1 水母——中華哲水蚤可能的食物類群

圖2 黃河口鄰近水域中華哲水蚤現(xiàn)場樣品使用18S通用引物和non－copepod引物所獲取的序列與在GenBank中匹配到的同源序列比對后構(gòu)建的鄰接樹（N－J樹）Fig.2 Neighbor joining tree of 18SrDNA sequences we obtained by 18Snon－copepod primers and their top－h(huán)it sequences from GenBank

基于18Snon－copepod引物的分子生物學(xué)分析檢測到了包括櫛水母和水螅水母在內(nèi)的水母類來源的序列。其中，櫛水母來源的序列屬于櫛水母門中的球櫛水母目（相似度為98%～99%）（見表2）。同步的大面調(diào)查資料顯示，黃河口及其鄰近水域分布的櫛水母僅記錄到球櫛水母目中的球形側(cè)腕水母（Pleurobrachia globosa）一種，在淺水I和淺水II型浮游生物網(wǎng)采集的浮游動物樣品中均有發(fā)現(xiàn)[35]。馬喜平和高尚武對渤海水母類的研究表明，渤海有2種櫛水母——球形側(cè)腕水母和兜水母（Bolinopsis）中的瓜水母（Boroecucumis）[36]。作者在GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有檢索到瓜水母的18SrDNA序列信息，這可能是櫛水母來源的序列匹配的最相近種類中沒有瓜水母的原因。

水螅水母來源的序列主要屬于花水母和軟水母?；ㄋ负蛙浰甘屈S河口及其鄰近水域[35]和渤海[37]常見的水螅水母，其中，八斑芮氏水母（Rathkeaoctopunctata）和和平水母屬（Eirene）是渤海水母類的優(yōu)勢種屬[36]。特別是八斑芮氏水母，同步的大面積調(diào)查資料顯示，調(diào)查區(qū)域內(nèi)八斑芮氏水母可占到水母總生物量的95%以上[35]。對渤海水母類的研究也表明，八斑芮氏水母的密度在5月份可占到水母類總密度的80%以上[38]，且主要出現(xiàn)在萊州灣。由此可見，中華哲水蚤潛在的食物類群——水螅水母和櫛水母在調(diào)查時間和區(qū)域內(nèi)均具有豐富的分布，意味著中華哲水蚤可能和它們有著很高的遭遇率。

一般認為，水母是水域生態(tài)系統(tǒng)重要的攝食者，是浮游植物、浮游動物、魚類卵和仔稚魚的主要消費者之一。關(guān)于八斑芮氏水母等與橈足類的營養(yǎng)關(guān)系研究中皆是八斑芮氏水母攝食橈足類的報道[39－40]。其它種類的水母（杯水母（Phialidiumlomae，P.gregarium）、薩氏水母（Sarsiapsinceps）、囊水母（Euphysatentaculata）、半口壯麗水母（Aglaurahemistoma）、海月水母（Aureliaaurita））等的攝食研究中也發(fā)現(xiàn)它們對橈足類的攝食[40－46]，并且有研究指出橈足類是某些水母種類的主要食物來源[45]。本文基于分子生物學(xué)技術(shù)的分析在中華哲水蚤的潛在食物類群中檢測出櫛水母類和水螅水母類，而且這2個類群在所有非中華哲水蚤來源的生物類群中占有絕對優(yōu)勢地位（52.0%）。除此之外，作者在青島近海的中華哲水蚤（2004年1月和2010年6月）、以及膠州灣的太平洋紡錘水蚤（2010年9月）樣品中均檢出數(shù)量豐富的水母類來源的序列（占潛在食物類群18SrDNA文庫的比例分別為44.4%、41.2%和68.4%）。潛在食物類群中水母類的普遍檢出和豐富比例意味著中華哲水蚤對這2類水母可能存在很強的攝食作用。

中華哲水蚤是一種雜食性橈足類?；谖改c內(nèi)含物電鏡分析的研究表明，其主要攝食以硅藻為主的浮游植物，還有少量的原生動物以及細菌等[18]。另外，基于脂肪酸組成分析的研究表明，中華哲水蚤除主要攝食浮游植物之外，還可能攝食有機碎屑、細菌及小型橈足類等[19]。盡管如此，以前的研究從未在其動物性餌料中發(fā)現(xiàn)水螅水母和櫛水母類生物，迄今為止，作者也未發(fā)現(xiàn)有關(guān)浮游橈足類對水母類生物攝食的報道?；跀z食者和食物大小關(guān)系的考慮，作者認為中華哲水蚤對櫛水母和水螅水母類中某些種類的攝食可能發(fā)生在卵到浮浪幼蟲階段。據(jù)此推測，橈足類可能在控制水母暴發(fā)、影響海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡中具有重要的潛在作用。

3.2 寄生性甲藻類群與中華哲水蚤的關(guān)系

Syndiniales是甲藻中的一大類群，其中許多均為寄生性種類。它們具有廣泛的宿主，包括其它甲藻、纖毛蟲、放射蟲、魚卵以及橈足類在內(nèi)的甲殼動物等[47－48]。5條甲藻來源的序列中4條屬于寄生性的Syndiniales，其中3條隸屬于其中的Euduboscquella屬，1條可能來源于Ichthyodinium屬。作為Syndiniales中的一個類群，Euduboscquella屬的研究較少，在已被描述的種類中，多是它們遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究[49]，未見有其與橈足類營養(yǎng)關(guān)系的報道。Ichthyodinium屬則經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)寄生于魚卵的卵黃囊內(nèi)[50]。

有許多生物與橈足類形成共生關(guān)系[51]，Syndiniales便是其中一個類群。較傳統(tǒng)方法，分子生物學(xué)方法的使用讓作者發(fā)現(xiàn)了更多與橈足類有關(guān)聯(lián)的生物類群，這些類群可能與橈足類形成共生關(guān)系，而與橈足類有著復(fù)雜的營養(yǎng)關(guān)系。雖然作者以研究橈足類的食物為目的，但認為基于序列分析檢出的Syndiniales這2個屬（Euduboscquella和Ichthyodinium）的種類與橈足類真實的營養(yǎng)關(guān)系尚不能判定為簡單的攝食與被攝食的關(guān)系，而需要借助其他手段進行更加深入地研究。

3.3 大型藻類在中華哲水蚤食物類群中的出現(xiàn)

通常，浮游食物網(wǎng)中有機物總是從小個體生物向較大個體生物依次傳遞，“小個體”的浮游動物對“大個體”的大型水生植物攝食的研究報道相對較少。曾有研究將大型水生植物Thalassiatestudinum的碎屑作為餌料，在實驗室條件下驗證了湯氏紡錘水蚤（Acartia tonsa）對這種海草碎屑的攝食[52]，但未見自然海區(qū)中有橈足類對大型水生植物攝食的報道。然而，曾有學(xué)者觀察到并且使用分子生物學(xué)手段證明了近岸潮間帶池塘中營混合營養(yǎng)的纖毛蟲Strombidiumoculatum和S.stylifer對大型綠藻中滸苔（Ulva）屬種類的攝食[53]，發(fā)現(xiàn)纖毛蟲可以攝食綠藻釋放的游動孢子細胞。作者在樣品中檢測到綠藻來源的序列，屬綠藻門石莼屬。石莼一般生長在海灣內(nèi)中低潮帶的巖石上或石沼中，廣泛分布于我國黃渤海沿岸[54]，在潮間帶的低、中、高潮帶均有分布[55]。石莼的生活史存在世代交替，隨環(huán)境變化，藻體能釋放大量孢子?；趯嶒灲Y(jié)果，本文認為中華哲水蚤可能是石莼屬藻類孢子或配子細胞的潛在攝食者，雖然也有可能攝食DNA未被完全降解的綠藻碎屑。

傳統(tǒng)認識中，大型藻類和海草等的歸宿是進入到碎屑食物鏈或被大型底棲生物所攝食[56]，進入到底棲食物鏈。本研究基于分子生物學(xué)檢測的結(jié)果與McManus等[53]關(guān)于纖毛蟲對大型藻類的攝食研究類似，展示了一個別樣的營養(yǎng)關(guān)系，表明大型藻類可以進入到浮游食物網(wǎng)中。作為一種繁殖策略，在有外界壓力脅迫或處于有利擴散條件時，綠藻可快速產(chǎn)出大量的孢子細胞。有研究表明大型石莼屬綠藻Ulvalactuca在生長季節(jié)可以釋放其生物量20%～60%的游動孢子細胞[57]。對于潮間帶池塘或近岸水域中的浮游生物，這種大型植物孢子的釋放可能給它們提供了周期性的重要食物來源。

致謝：感謝本課題組的房靜和李自尚等同學(xué)協(xié)助采集樣品。

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