韓麗蓉，徐 瑋，汪東風(fēng)，王艷龍

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266003）

刺參（Apostichopusjaponicus）又稱仿刺參，習(xí)慣上稱為海參，隸屬于棘皮動(dòng)物門，海參綱，楯手目，刺參科，仿刺參屬[1]，具有很高的經(jīng)濟(jì)、藥用和醫(yī)用保健價(jià)值[2－3]。隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)刺參的需求不斷增加，從而引發(fā)了刺參的過度捕撈，導(dǎo)致刺參自然資源瀕臨枯竭[4]。為解決需求與資源的矛盾，刺參的人工養(yǎng)殖技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并迅速發(fā)展，成為我國繼中國對(duì)蝦、扇貝后的又一大養(yǎng)殖品種。然而刺參的大規(guī)模無序養(yǎng)殖誘發(fā)了刺參病害孽生，嚴(yán)重制約著該產(chǎn)業(yè)的健康和可持續(xù)性發(fā)展[5－6]。而化學(xué)藥品和抗生素的過量濫用帶來了環(huán)境污染，造成了食品安全隱患，破壞了刺參的內(nèi)穩(wěn)定和自身免疫反應(yīng)。因此，尋找安全、有效、健康的免疫增強(qiáng)劑勢(shì)在必行。

刺參隸屬于棘皮動(dòng)物，與其他無脊椎動(dòng)物一樣，刺參缺乏特異性免疫系統(tǒng)，關(guān)鍵防御機(jī)制受細(xì)胞免疫應(yīng)答和非細(xì)胞的體液應(yīng)答調(diào)節(jié)[7]，依賴天然免疫機(jī)制對(duì)進(jìn)入動(dòng)物體的異物進(jìn)行識(shí)別、排除，或使異物變成無害物質(zhì)，以及傷口修復(fù)等[8－10]。因此，通過有效途徑提高體腔細(xì)胞的活性，對(duì)提高刺參免疫反應(yīng)具有重要的意義。

殼聚糖是甲殼素經(jīng)脫乙?；幚砗蟮漠a(chǎn)物，具有廣譜抗菌和促生長的作用，作為飼料添加劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于異育銀鯽（Carassiusauratusgibelio）、羅非魚（Tilapianilotica）、大黃魚（Pseudosciaenacrocea）、真鯛（SparusaurataL.）等。殼寡糖是殼聚糖降解后的產(chǎn)物，由2～10氨基葡萄糖通過β－1，4－糖苷鍵連接而成，分子量＜5 000，具有促進(jìn)腸道菌群增值[11]、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[12－13]、抗氧化[14－15]等提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫反應(yīng)以及抗病力的作用[16－17]。然而其在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究卻鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以刺參為對(duì)象，通過在飼料中添加殼寡糖來研究其對(duì)刺參生長、免疫反應(yīng)和抗病力的影響，以期為刺參免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以馬尾藻、魚粉、面粉、豆粕等為基礎(chǔ)原料，配制成粗蛋白含量22.58%，粗脂肪含量2.48%的基礎(chǔ)飼料（見表1）。在基礎(chǔ)飼料中加入0、0.25%、0.50%、1.00%和2.00%的殼寡糖制成實(shí)驗(yàn)飼料。原料均過100目篩，混勻后加入水制成面團(tuán)，用雙螺旋擠壓機(jī)（F－26（Ⅱ）華南理工大學(xué)）擠壓稱直徑為1mm的顆粒，在鼓風(fēng)干燥器中44℃烘干，烘干的飼料粉碎后過篩，取40～80目中間顆粒作為實(shí)驗(yàn)用飼料，密封保存。

殼寡糖由大連化學(xué)物理研究所提供，分子量＜1 000，純度＞97%。

1.2 樣品的養(yǎng)殖、采集與處理

所用刺參購自山東省青島市田橫刺參育苗場(chǎng)。在循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間飼喂基礎(chǔ)飼料。暫養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)分組，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18頭刺參（5.28±0.03）g。養(yǎng)殖試驗(yàn)在中國海洋大學(xué)鰲山衛(wèi)基地室內(nèi)水族箱中進(jìn)行，水族箱體積為60L。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫（16±1）℃，鹽度29.0±1.0，pH＝8.0±0.3。每天早晚各投喂1次，飽食投喂，并吸底排污1次，進(jìn)行8周的養(yǎng)殖試驗(yàn)。

8周養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)刺參饑餓24h，然后計(jì)數(shù)、稱重。對(duì)每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取4頭刺參，解剖取其體腔液，吸取抗凝劑（0.02mol/L EGTA，0.48mol/L NaCl，0.019mol/L KCl，0.068mol/L Tris－HCl，pH＝7.6），與體腔液1：1混合，得到抗凝體腔液?？鼓w腔液一部分直接用于體腔細(xì)胞計(jì)數(shù)、吞噬活性和呼吸爆發(fā)活力的測(cè)定；另一部分離心10min（3 000×g，4℃）后，棄去上清，所得的體腔細(xì)胞沉淀用等體積預(yù)冷的生理鹽水重新懸浮。懸液用超聲波（22kHz，25×6s，0℃）破碎后，4 000×g離心10min（4℃），所得上清液即為體腔細(xì)胞破碎上清液（CLS），CLS用于一氧化氮合酶活力、超氧化物歧化酶活和酸性磷酸酶（ACP）活力的測(cè)定。

1.3 攻毒試驗(yàn)

生長實(shí)驗(yàn)8周結(jié)束后，隨機(jī)從每缸中抽取9頭刺參進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。攻毒實(shí)驗(yàn)所用菌株為燦爛弧菌（Vibrio splendidu），由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所提供，是刺參“腐皮綜合征”主要致病菌[6]。燦爛弧菌用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），28℃下培養(yǎng)24h，然后用無菌生理鹽水沖洗菌落，并將濃度調(diào)整至1×108CFU/mL。攻毒實(shí)驗(yàn)前首先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定刺參7d的半致死濃度LD50為1×107CFU/mL。每頭刺參經(jīng)腹腔注射0.1mL菌液。對(duì)刺參進(jìn)行2周的死亡情況觀察，最后計(jì)算刺參2周內(nèi)的累積死亡率。

1.4 樣品的分析測(cè)定

1.4.1 特定生長率 特定生長率計(jì)算公式如下：

特定生長率（SGR）＝ （lnWt－lnW0）×100/t，其中：Wt為刺參終末體重；W0為刺參初始體重；t為養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的天數(shù)（56d）

1.4.2 體腔細(xì)胞計(jì)數(shù) 取50μL刺參體腔液加入到150μL戊二醛固定液中，利用血球計(jì)數(shù)板在10×40倍光學(xué)顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，計(jì)算出刺參體腔細(xì)胞的密度。

1.4.3 吞噬活性的測(cè)定 吞噬活性采用吞噬中性紅的方法進(jìn)行測(cè)定[18－20]，并略有改動(dòng)。取100μL刺參體腔細(xì)胞抗凝液加入到96孔板中，貼壁30min后，棄上清，然后加入100μL 0.001mol/L的中性紅溶液，待體腔細(xì)胞吞噬中性紅30min后，再用生理鹽水輕輕洗去未被體腔細(xì)胞吞噬的中性紅。加入100μL細(xì)胞裂解液（冰醋酸∶無水乙醇＝1∶1，v/v），對(duì)刺參體腔細(xì)胞裂解20min后，在96孔板中加入細(xì)胞裂解液裂解20 min，用全波長酶標(biāo)儀540nm下測(cè)定吸光值（OD540），以實(shí)驗(yàn)條件下每106個(gè)體腔細(xì)胞的吸光值表示刺參體腔細(xì)胞的吞噬能力。

1.4.4 呼吸爆發(fā)活力的測(cè)定 參考Song和Hsieh方法[21]，略有改動(dòng)。在96微孔板中先加入50μL 0.2%多聚賴氨酸（Poly－L－lysine，Sigma）增加96孔板的吸附能力，然后加入100μL抗凝刺參體腔液，離心10min（300×g，4℃），去除上清，然后加入100μL（1μg/mL）PMA （Phorbol myristate acetate，Sigma），溫育30min（37℃），然后加入100μL 0.3%NBT（Nitroblue tetrazolium，Sigma），在37℃下，溫育30min后，經(jīng)離心10min（560×g，4℃），去除上清后加入200 μL 100%純甲醇終止反應(yīng)（10min），經(jīng)離心10min（700×g，4℃），去除上清，再用70%甲醇反復(fù)洗滌3次，離心去除上清，于室溫下晾干。干燥后，加入120 μL 2mol/L KOH 和140μL DMSO（二甲基亞砜），充分溶解孔內(nèi)物質(zhì)；在酶標(biāo)儀中測(cè)定溶液在630nm下的吸光值（OD630），以實(shí)驗(yàn)條件下每106個(gè)體腔細(xì)胞對(duì)應(yīng)的吸光值（OD630）大小來表示呼吸爆發(fā)活力。

1.4.5 總超氧化物歧化酶（T－SOD）的測(cè)定 使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的總超氧化物歧化酶（TSOD）測(cè)試盒，采用黃嘌呤氧化酶法進(jìn)行測(cè)定。以每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U/mL）。

1.4.6 一氧化氮合酶（NOS）活力測(cè)定 使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的NOS測(cè)定試劑盒。通過NOS催化L－Arg與分子氧發(fā)生反應(yīng)生成NO，進(jìn)而與親和物質(zhì)生成有色化合物的量來判斷NOS活力的大小，按照試劑盒的操作手冊(cè)要求進(jìn)行。以每毫升CLS每分鐘生成1nmol NO為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.4.7 酸性磷酸酶（ACP）的測(cè)定 采用酸性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)磷酸苯二鈉法，按照試劑盒的操作手冊(cè)要求進(jìn)行。以每克CLS在37℃下與基質(zhì)作用30min產(chǎn)生1mg酚的酶量為1個(gè)活力單位（U/g prot）。

1.4.8 體腔細(xì)胞蛋白含量的測(cè)定 采用Bradford[22]方法通過考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行測(cè)定，以小牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。并用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行顯色，反應(yīng)在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，在酶標(biāo)儀中測(cè)定各反應(yīng)體系中的OD595值。

1.4.9 刺參的累計(jì)死亡率 累計(jì)死亡率計(jì)算公式如下：

累積死亡率/% （Cumulative mortality）＝DT/D0×100%，

其中：D0和DT分別為攻毒過程中刺參初始頭數(shù)和累計(jì)死亡頭數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（Mean±S.E.M）采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)單因素方差分析（ANOVA）達(dá)顯著水平時(shí)（P＜0.05），進(jìn)行Tukey多重比較。

2 結(jié)果

2.1 殼寡糖對(duì)刺參生長的影響

經(jīng)過8周的養(yǎng)殖試驗(yàn)，飼料中添加殼寡糖對(duì)仿刺參特定生長率有促進(jìn)作用，與對(duì)照組相比，添加0.50%COS成活率提高了11.77%，但沒有顯著性差異（P＞0.05）（見表1）。

2.2 殼寡糖對(duì)刺參免疫反應(yīng)的影響

2.2.1 吞噬活性 殼寡糖能提高刺參體腔細(xì)胞中的吞噬能力，吞噬能力在2.00%組達(dá)到最高，但與對(duì)照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），各處理組之間也無顯著性差異（P＞0.05）（見表2）。

2.2.2 呼吸爆發(fā) 殼寡糖能顯著提高刺參體腔細(xì)胞的呼吸爆發(fā)能力（P＜0.05），當(dāng)飼料中殼寡糖添加量為0.50%時(shí)，顯著高于殼寡糖添加量為2.00%處理組以及對(duì)照組（見表2）。

2.2.3 總超氧化物歧化酶 與對(duì)照組相比，飼料中添加殼寡糖對(duì)刺參體腔細(xì)胞的總超氧化物歧化酶活力沒有顯著影響（P＞0.05），但各處理組織之間，殼寡糖添加量為1.00%組總超氧化物歧化酶活力顯著高于0.25%處理組（P＜0.05）（見表2）。

2.2.4 酸性磷酸酶 殼寡糖對(duì)刺參體腔細(xì)胞的酸性磷酸酶活力有顯著性影響（P＜0.05）。且隨飼料中添加殼寡糖含量的升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，各處理組酸性磷酸酶活力都顯著性低于對(duì)照組（P＜0.05），且最高劑量組，即殼寡糖添加量為2.00%組，酸性磷酸酶活力顯著低于其他各處理組（P＜0.05）（見表2）。

表1 飼料中添加殼寡糖對(duì)刺參生長性能的影響（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝4）1Table 1 Effects of dietary chitosan oligosaccharide on the growth of sea cucumber（A.japonicus）（Means±SE，n＝4）1

表2 飼料中添加殼寡糖糖對(duì)刺參免疫反應(yīng)的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝4）1Table 2 Effects of dietary chitosan oligosaccharide on immune response of sea cucumber（A.japonicus）（Means±SE，n＝4）1

2.2.5一氧化氮合酶 飼料中添加殼寡糖顯著提高了刺參體腔細(xì)胞中一氧化氮合酶的活力，一氧化氮合酶活力在0.50%處達(dá)到最高，與空白對(duì)照組、最低劑量組（0.25%）以及最高劑量組（2.00%）都存在顯著性差異（P＜0.05）（見表2）。

2.3 攻毒實(shí)驗(yàn)

飼料中添加殼寡糖對(duì)刺參抵抗?fàn)N爛弧菌（V.splendidus）免疫保護(hù)力的測(cè)定結(jié)果見圖1。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，各組刺參14d的累積死亡率分別為52.78%、47.22%、36.11%、41.67%和55.56%，殼聚糖添加量為0.25%、0.50%和1.00%處理組的死亡率均低于對(duì)照組的死亡率，殼聚糖添加量為2.00%處理組的死亡率高于對(duì)照組，但并無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 投喂不同水平殼寡糖對(duì)刺參攻毒后死亡率的影響（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝4）Fig.1 Effects of dietary chitosan oligosaccharide on cumulative mortality of sea cucumber（A.japonicus）after infection with V.splendidus.（Means±SE，n＝4）

3 分析與討論

3.1 飼料中添加不同水平的殼寡糖對(duì)刺參生長的影響

殼寡糖作為飼料添加劑，已經(jīng)在畜牧和水產(chǎn)類養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用。同時(shí)殼寡糖對(duì)魚類等水產(chǎn)動(dòng)物的生長促進(jìn)作用，已在許多研究中得到證實(shí)。Refstie等[23]用含寡糖的餌料飼喂大西洋鮭，55d后與對(duì)照組相比，大西洋鮭的增重率和飼料系數(shù)都存在顯著性差異（P＜0.05）。孫立偉等[24]用添加不同濃度殼寡糖的飼料，飼喂吉富羅非魚幼魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加0.3%～0.5%殼寡糖可顯著提高吉富羅非魚幼魚生長性能以及飼料利用率。孫含亮等[25]在基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的殼寡糖，飼養(yǎng)虹鱒，發(fā)現(xiàn)添加0.50%、0.75%和1.00%殼聚糖可以顯著提高虹鱒的特定生長率。本實(shí)驗(yàn)研究中，在飼料中添加不同濃度的殼寡糖，對(duì)刺參生長都有一定促進(jìn)作用，以0.50%殼寡糖最為明顯，與對(duì)照組相比刺參的特定生長率提高了11.77%。隨著殼寡糖濃度的增加，特定生長率呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢(shì)，表明高劑量殼寡糖對(duì)刺參的特定生長率有抑制作用，但在劑量2.00%殼寡糖處作用不顯著。與其他的蝦類和魚類相比，刺參的生長速率較慢，因此在56d的養(yǎng)殖周期內(nèi)，表現(xiàn)的促生長作用不顯著[26]。

3.2 飼料中添加不同水平的殼寡糖對(duì)刺參免疫反應(yīng)的作用

殼寡糖作為一種寡糖類免疫增強(qiáng)劑，其免疫促進(jìn)作用已經(jīng)在許多研究中得以證實(shí)。Suzuki等[27]研究發(fā)現(xiàn)COS能增強(qiáng)T細(xì)胞表面IL－2受體的表達(dá)，加速T細(xì)胞的成熟以及分化成熟為效應(yīng)T細(xì)胞。Wu和Tsai[28]研究發(fā)現(xiàn)COS能顯著增加小鼠IgG和IgM的含量。徐后國等[29]在飼料中添加了0.3%和0.6%的殼寡糖，顯著提高了大黃魚幼魚血清溶菌酶活力大小。免疫酶活常被用做衡量刺參免疫活力高低的指標(biāo)[30－32]。江小璐等[33]在基礎(chǔ)飼料中添加0.1%的褐藻寡糖，研究其對(duì)酚氧化酶（POD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）活性的影響，發(fā)現(xiàn)寡糖均能顯著提高POD、ACP、AKP和LZM的活性。趙彥翠等[26]研究表明，當(dāng)殼聚糖的添加量為10g/kg時(shí)，刺參體腔細(xì)胞密度和吞噬活性得到顯著提高，對(duì)刺參體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力有提高的作用，并且顯著降低酸性磷酸酶的活力。在本實(shí)驗(yàn)中，飼料中添加0.50%COS對(duì)刺參的免疫反應(yīng)有一定的刺激作用，表現(xiàn)為顯著提高了刺參體腔細(xì)胞的呼吸爆發(fā)能力和NOS活力，同時(shí)COS顯著抑制了酸性磷酸酶的活性，與李振達(dá)等[34]的研究結(jié)果不一致。這可能與實(shí)驗(yàn)物種、實(shí)驗(yàn)條件以及殼寡糖的聚合度等有關(guān)。

3.3 飼料中添加不同水平的殼寡糖對(duì)刺參抗病力的影響

很多研究表明，寡糖具有抗生素作用，可作為抗生素替代物用于提高細(xì)菌性疾病的預(yù)防以及防御[35]。COS在體外的抑菌實(shí)驗(yàn)表明，濃度為0.3%～0.5%的COS對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、防線球菌、八疊球菌以及枯草桿菌都有抑制作用[36]。No等[37]研究了不同分子量殼寡（聚）糖對(duì)豆腐制品中腐生菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同分子量殼寡（聚）糖對(duì)豆腐制品中腐生菌中的一些芽孢桿菌產(chǎn)生了不同的抑制作用。此外，飼料中添加殼聚糖還可以顯著提高異育銀鯽[38]、暗紋東方鲀[39]和草魚[40]抵抗嗜水氣單胞菌的能力。關(guān)于其抑菌機(jī)理，有研究認(rèn)為，有些寡糖與病原菌（如霍亂菌、大腸桿菌、沙門氏菌等）在腸壁上的受體具有類似結(jié)構(gòu)，與病原菌可競爭性的結(jié)合，甚至把已結(jié)合的病原菌部分置換下來，保障腸黏膜細(xì)胞的完整性，達(dá)到防治疾病發(fā)生的作用。在本實(shí)驗(yàn)研究中，添加殼寡糖降低了燦爛弧菌攻毒后刺參的死亡率，但與對(duì)照組相比并沒有顯著差異，這與趙彥翠[26]究結(jié)果一致。

4 結(jié)語

本文首次研究了殼寡糖對(duì)刺參生長、免疫反應(yīng)和抗病力的影響。結(jié)果表明，飼料中添加殼寡糖對(duì)刺參的生長有一定程度的促進(jìn)作用，能提高機(jī)體免疫反應(yīng)，并在一定程度上增強(qiáng)刺參抗病力?？傮w上來說，飼料中添加殼寡糖對(duì)刺參生長和抗病力具有一定的影響作用，但殼寡糖在刺參養(yǎng)殖方面的實(shí)際應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究。

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