韓寶芹，杜 芳，畢慶慶，楊 艷，劉偉治，劉萬(wàn)順

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003）

隨著人口老齡化加速、生活水平提高和壓力增大，血栓類(lèi)疾病呈逐步上升趨勢(shì)。血栓疾病是一種血管內(nèi)腔狹窄、循環(huán)系統(tǒng)閉塞引發(fā)的常見(jiàn)血管性疾病。靜脈血栓主要引發(fā)肺栓塞，而動(dòng)脈血栓會(huì)導(dǎo)致心肌梗塞、中風(fēng)、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥和外周動(dòng)脈性疾病。據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）慢性病中心的統(tǒng)計(jì)資料顯示，心腦血管病是目前我國(guó)發(fā)病率、致殘率和死亡率最高的疾病[1]。因此，市場(chǎng)對(duì)溶栓劑需求將逐步增加，迫切需要療效好、半衰期長(zhǎng)且安全性高的溶栓藥物。

目前具有代表性的纖溶酶如納豆激酶和蚓激酶都已進(jìn)入臨床應(yīng)用[2－3]，并且通過(guò)基因工程的手段得到了有活性的纖溶酶[4－5]。但海洋來(lái)源的纖溶酶基因克隆表達(dá)的工作還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)多年研究，從海洋無(wú)脊椎動(dòng)物單環(huán)刺螠中分離純化得到1組新型纖溶酶，命名為單環(huán)刺螠纖溶酶（UFE），該酶包括4個(gè)分子量組分，按照分子量由大到小，分別是UFEⅠ、UFEⅡ、UFEⅢ、UFEⅣ。經(jīng)研究4個(gè)UFE均具有顯著的抗凝、纖溶活性和較好的生物安全性，具有較大的開(kāi)發(fā)價(jià)值[6－9]。但從生物體內(nèi)直接分離提取存在耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，產(chǎn)率低等問(wèn)題。為解決上述問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)室已完成UFEⅢ的基因克隆及構(gòu)建了真核表達(dá)載體，本研究將進(jìn)一步完成UFEⅢ的克隆和生物信息學(xué)分析，在此基礎(chǔ)上重組原核表達(dá)載體，以實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)，為進(jìn)一步獲得重組活性蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

單環(huán)刺螠（Urechisunicinctus）購(gòu)自青島市南山市場(chǎng)；UFEⅢ是本實(shí)驗(yàn)室制備；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自博邁德公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；PMD18－T、ExTaq聚合酶、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、5′－Full RACE Kit，TaKaRa；pET32a、pET28a及Rosetta2（DE3）為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所饋贈(zèng)；丙烯酰胺、N，N′－甲叉雙丙烯酰胺等分析純購(gòu)自華晟科技有限公司；小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體、羊抗小鼠IgG－HRP、DAB顯色試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)測(cè)序 UFEⅢ由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司測(cè)序，N端序列為IIGGSNAAITSY。

1.2.2 單環(huán)刺螠總RNA的提取及cDNA第一鏈合成

Trizol法提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，根據(jù)PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行并用設(shè)計(jì)合成的3′RACE Adoptor 5′－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTT－3′代替 Oligo dT Primer作為反轉(zhuǎn)錄引物，得到cDNA第一條鏈。

1.2.3 簡(jiǎn)并PCR 根據(jù)已測(cè)得的蛋白N端序列設(shè)計(jì)兩條正向簡(jiǎn)并引物分別為211：5′－GCNG CNATHACNTCNTAC－3′，212：5′－GCNGCNATHACNAGYTAC－3′，根據(jù)3′RACE Adoptor設(shè)計(jì)反向引物 OP：5′－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT－3′。利 用 Touchdwn PCR擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收得到的片段與PMD18－T連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.ColiDH5α，涂布含有Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)后，利用菌落PCR篩選到陽(yáng)性菌株進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 5′RACE PCR 根據(jù)5′－Full RACE Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行5′－Full RACE PCR。所用引物根據(jù)簡(jiǎn)并 PCR的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)，GSP1：5′－TACTCCCACAAGCAGATTGCCACAG－3′， GSP2： 5′－TGATTAATGCGGGATGCCACACTG－3′，擴(kuò)增體系及參數(shù)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，其中退火溫度為55℃，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，經(jīng)回收后，進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 UFEⅢ基因全長(zhǎng)擴(kuò)增 根據(jù)5′RACE PCR的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)正向引物ust：5′－GGAAACCACAATGAAGACCATCCT－3′，根據(jù)簡(jiǎn)并PCR的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)反向引物OP：5′－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT－3′。擴(kuò)增體系為：cDNA 模板 1μL，ExTaq0.25μL，10×ExTaqbuffer 5μL，dNTP 4μL，ust（10 μmol/L）2μL，OP（10μmol/L）2μL，ddH2O 35.75 μL，總體積50μL，PCR擴(kuò)增退火溫度為54℃。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 使用 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BlASTx程序?qū)?UFEⅢ的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，使用BioEdit軟件將cDNA序列翻譯為氨基酸序列，對(duì)推導(dǎo)出的蛋白序列利用NCBI保守區(qū)域數(shù)據(jù)庫(kù)CDD（Conserved Domain Database）及PROSITE軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域、活性位點(diǎn)及二硫鍵的預(yù)測(cè)，SingalP程序分析信號(hào)肽，利用SWISS MODEL法對(duì)該蛋白進(jìn)行構(gòu)象預(yù)測(cè)。

1.2.7 pET32a－UFE/pET28a－UFE 重組載體的構(gòu)建根據(jù)UFEⅢ克隆片段及載體pET32a/pET28a上酶切位點(diǎn)的特性，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物 E5Sen：5′－GGATCCATCATTGGAGGCAGCAATGC－3′，E5Anti： 5′－CTCGAGGTTGTTGTTGATCCAGG－3′，內(nèi)設(shè)BamH1和Xho1酶切位點(diǎn)，以PMD18－T－UFE為模板，進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與PMD18－T連接，測(cè)序后，測(cè)序正確的PMD18－T－UFEⅢ與pET32a/pET28a分別進(jìn)行BamH1和Xho1雙酶切，回收酶切后的片段，用T4連接酶16℃連接過(guò)夜。

1.2.8 重組載體轉(zhuǎn)化Rosetta2（DE3） 按常規(guī)方法制備Rosetta2（DE3）感受態(tài)細(xì)胞[10]，4℃放置過(guò)夜后，將重組載體pET32a－UFE/pET28a－UFE分別轉(zhuǎn)化入Rosetta2（DE3）中，取100μL轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有Amp＋和Cam＋的LB固體平板上37℃培養(yǎng)12～16h。

1.2.9 UFE在Rosetta2（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取1.2.8中的菌落，接種入5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜活化。次日，將活化后的菌液按1∶100轉(zhuǎn)接入100mL的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃培養(yǎng)至OD600＝0.6后，分別加入終濃度為0.2、1mmol/L的IPTG 分別進(jìn)行過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。次日，4℃，6 000r/min離心30min收集菌體，用20mmol/L的 Tris－HCl（pH＝8），200mmol/L NaCl的破碎緩沖液洗滌后懸浮，超聲波破碎（工作5s，間歇10s）。離心分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè)。

破碎得到的蛋白上清液（pET32a－UFE）上樣于預(yù)先經(jīng)破碎緩沖液平衡的 Ni2＋－NTA 柱，用20mmol/L咪唑洗脫雜蛋白后，用咪唑梯度 50、100、200、400 mmol/L洗脫目的蛋白，收集洗脫液進(jìn)行SDS－PAGE和Western Bloting法檢測(cè)，WB方法參考博士德 W－B試劑盒說(shuō)明書(shū)，其中一抗為小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體，按1∶1 500稀釋?zhuān)篂檠蚩剐∈驣gG－HRP，按1∶400稀釋。其余的留樣用Bradford法檢測(cè)蛋白含量后，用纖維蛋白平板法測(cè)酶活[11]。破碎菌液（pET28a－UFE）得到的包涵體，溶于變性緩沖液中（6mol/L鹽酸胍，200mmol/L NaCl，20mmol/L Tris－HCl（pH＝8），15mmol/L Dithiothreitol），至蛋白終濃度0.1～0.2 mg/mL，4℃溶解過(guò)夜。4℃，12 000r/min，離心15 min，收集上清后，將蛋白溶解液裝入透析袋中，放入500mL鹽酸胍梯度復(fù)性緩沖液中，分別透析8～12h，復(fù)性緩沖液為20mmol/L Tris－HCl（pH＝8），100 mmol/L NaCl，1mol/L的 Arg，分別加入3、2、1mol/L的鹽酸胍，最后透析至20mmol/L Tris－HCl（pH＝8），100mmol/L NaCl中。之后，4℃，12 000r/min，離心15min，收集上清，進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè)，纖維蛋白平板測(cè)酶活性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 單環(huán)刺螠總RNA的提取

新鮮蟲(chóng)體提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，可見(jiàn)到較清晰的28、18、5s條帶，OD260∶OD280的值為1.781。

2.2 UFEⅢ全長(zhǎng)擴(kuò)增

2.2.1 簡(jiǎn)并PCR及5′RACE PCR 以總 RNA為模板，3′RACE Adoptor為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一條鏈，以此為模板，以212和OP分別為正反向引物，擴(kuò)增出約750bp的產(chǎn)物，根據(jù)得到的簡(jiǎn)并PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)引物，利用5′RACE試劑盒擴(kuò)增得到約300bp的產(chǎn)物，該產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與簡(jiǎn)并PCR的測(cè)序結(jié)果約有208個(gè)堿基的重疊。

2.2.2 UFEⅢ全長(zhǎng)擴(kuò)增 根據(jù)簡(jiǎn)并PCR及5′RACE PCR的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)正反向引物擴(kuò)增UFEⅢ全長(zhǎng)，得到大小約900bp的PCR產(chǎn)物。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到UFEⅢ全長(zhǎng)cDNA序列（見(jiàn)圖1）。全長(zhǎng)cDNA為863bp，其中開(kāi)放閱讀框?yàn)?86bp（Gen－Bank accession number KC695751）。

2.2.3 UFEⅢ的生物信息學(xué)分析 利用BlASTx軟件對(duì)UFEⅢ進(jìn)行同源性比對(duì)（見(jiàn)圖2），結(jié)果顯示，該酶與本實(shí)驗(yàn)之前克隆到的UFEⅡ[12]在蛋白序列上有45%的相似性，并且經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證UFEⅡ和UFEⅢ都有降解纖維蛋白的功能[11]，初步判斷UFEⅡ和UFEⅢ為存在于單環(huán)刺螠體內(nèi)具有纖溶活性的同工酶。其他與之相似度較高的蛋白為沙躅胰凝乳蛋白酶，蚓激酶，蚯蚓纖溶酶等。

圖1 UFEⅢ基因及其編碼的氨基酸序列帶有下劃線(xiàn)依次為：起始密碼子，蛋白質(zhì)N端序列，終止密碼子Fig.1 Nucleotide squence and deduced amino acid sequence of the UFEⅢ.Underline：start codon，protein N terminal squence，stop codon

利用NCBI的保守?cái)?shù)據(jù)庫(kù)CDD（Conserved Domain Database）分析UFEⅢ的保守性。結(jié)果顯示該酶屬于胰蛋白酶樣絲氨酸酶家族，通常為無(wú)活性的前體形式，經(jīng)過(guò)限制性蛋白酶水解產(chǎn)生有活性的酶，酶切位置第33～34氨基酸處，預(yù)測(cè)的剪切位置與蛋白質(zhì)N端序列位置吻合。UFEⅢ中存在12個(gè)半胱氨酸，其中有6個(gè)參與形成了3對(duì)二硫鍵（Cys61－Cys77，Cys154－Cys222，Cys185－Cys203），這些二硫鍵的存在使其所在的超二級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固。此外有3個(gè)絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)，3個(gè)特異性底物結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步使用PROSITE軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，該蛋白質(zhì)含有1個(gè)trypsin domain位于第34～261位置處，與蛋白質(zhì)N端位置一致，其中第76位處的（H），第122位處的（D），第216位處的（S）為其活性位點(diǎn)。

圖2 UFEⅢ的蛋白相似性比對(duì)Fig.2 Similarity comparison of amino acid between UFEⅢ with other protein in database

根據(jù) SignalP（http：//cbs.dtu.dk/services/SignalP）信號(hào)肽分析軟件對(duì)UFEⅢ氨基酸序列的分析，該蛋白在第16和17個(gè)氨基酸處被信號(hào)肽酶切的可能性較大，因此該酶的信號(hào)肽應(yīng)該是包含1～16個(gè)氨基酸。UFEⅢ的成熟肽共有228個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為23 192.90Da，等電點(diǎn)約為8.58。

使用SWISS MODEL法對(duì)該蛋白進(jìn)行構(gòu)象預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)上與來(lái)自于Eiseniafetida的纖溶酶有40%的相似性，所以以Eiseniafetida的纖溶酶的三維晶體結(jié)構(gòu)（PDB：1m9uA）為模板構(gòu)建出的UFE三級(jí)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖3），該蛋白的核心結(jié)構(gòu)接近全β結(jié)構(gòu)，這些β折疊往往含較多的非極性殘基，埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部形成疏水核心。

圖3 UFE三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The predicted 3Dstructure of UFE

2.3 UFE在原核中的表達(dá)

2.3.1 UFE表達(dá)載體的構(gòu)建 以克隆到的UFE的基因全長(zhǎng)為模板，PCR得到約680bp的產(chǎn)物，BamH1、Xho1雙酶切PCR產(chǎn)物及pET32a和pET28a，T4連接酶16℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，酶切檢驗(yàn)后測(cè)序選取正確的陽(yáng)性克隆提取重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2.3.2 UFE的重組表達(dá) 將重組載體pET32a－UFE和空載體pET32a分別轉(zhuǎn)入 Rosetta2（DE3）中，在0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下，22℃過(guò)夜誘導(dǎo)后，超聲破碎，收集上清和包涵體。上清過(guò)Ni柱，純化目的蛋白。從圖中看到在44kD附近位置處有特異性的條帶（目的蛋白為23kD，融合Trx標(biāo)簽后為43kD），而空載對(duì)照無(wú)此蛋白，雖然目的蛋白大部分以包涵體的形式表達(dá)，但上清中也得到了少量表達(dá)，并且也純化出了部分蛋白（見(jiàn)圖4），經(jīng) WB檢測(cè)此蛋白為目的蛋白（見(jiàn)圖5），但在纖維平板上未檢測(cè)到明顯的纖溶活性（陽(yáng)性對(duì)照為從單環(huán)刺螠體內(nèi)提取到的天然UFEⅢ，陰性對(duì)照為空載誘導(dǎo)表達(dá)后的上清）。分別將重組載體pET28a－UFE和空載體pET28a轉(zhuǎn)入Rosetta2（DE3）宿主菌中，在1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下，30℃過(guò)夜誘導(dǎo)，超聲破碎，SDS－PAGE檢測(cè)（見(jiàn)圖6），電泳顯示，目的蛋白以包涵體的形式得到了表達(dá)，收集包涵體后，進(jìn)一步進(jìn)行蛋白復(fù)性實(shí)驗(yàn)，復(fù)性結(jié)束后，離心取上清進(jìn)行SDSPAGE和纖維平板活性檢測(cè)，從圖中看到，雖然復(fù)性后的蛋白以可溶的形式存在，但仍未檢測(cè)到明顯的纖溶活性（見(jiàn)圖7）。

圖4 UFE上清蛋白表達(dá)Fig.4 Supernatant recombinant protein expresion of UFE

圖5 Trx－UFE的免疫印跡Fig.5 Western Blotting of Trx－UFE

3 討論

圖6 UFE包涵體表達(dá)Fig.6 Inclusion body expresion of UFE

圖7 UFEⅢ的纖溶活性測(cè)定Fig.7 Fibrinolytic activity of product UFEⅢ on fibrin plate

本研究首次克隆得到了UFEⅢ的基因序列，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，增加了對(duì)該蛋白的了解，為其功能研究做了理論基礎(chǔ)，對(duì)翻譯后蛋白活性調(diào)節(jié)有一定的理論意義。與之前本實(shí)驗(yàn)室克隆到的UFEⅡ進(jìn)行了基因及氨基酸序列的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其在氨基酸序列上有45%的相似性，為今后纖溶酶的基因改造以及探究其體內(nèi)多種纖溶酶的作用機(jī)理和遺傳特征奠定基礎(chǔ)。

本研究綜合考慮蛋白表達(dá)后的用途及安全性等方面，首選了大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建了硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）與 UFE 的融合蛋白 Trx－UFE在Rosetta2（DE3）中表達(dá)，得到了一定量可溶性的目的蛋白，后期也嘗試過(guò)把可溶部分的標(biāo)簽切除，卻仍未獲得有活性的纖溶酶，究其原因，是由于大腸桿菌胞內(nèi)缺乏幫助該真核蛋白正確折疊的分子伴侶及二硫鍵形成的氧化還原酶，而且該基因來(lái)自于海洋生物，基因組序列存在一定的特殊性。這個(gè)結(jié)果也表明了雖然融合蛋白可以幫助目的蛋白以可溶的形式存在，但對(duì)某些蛋白的正確折疊所起的作用不明顯。

由于在大腸桿菌胞內(nèi)未得到有活性的纖溶酶，所以又構(gòu)建了不含融合標(biāo)簽的重組載體pET28a－UFE，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)，包涵體的復(fù)性等嘗試，最后也得到了可溶的目的蛋白，但仍未檢測(cè)到活性，分析原因可能是該蛋白在復(fù)性的過(guò)程中形成了穩(wěn)定的中間體但未形成其正確的蛋白構(gòu)象。由于蛋白質(zhì)體外復(fù)性的過(guò)程較復(fù)雜，雖然目前已經(jīng)報(bào)道了許多復(fù)性的方法，但因蛋白質(zhì)的性質(zhì)各異，尚沒(méi)有一種對(duì)所有蛋白質(zhì)都適用的方法[13]。 根據(jù)許 多研究者對(duì)蛋白復(fù)性機(jī)制的研究[14－15]，認(rèn)為肽鏈折疊成活性蛋白并不是一步完成的，在蛋白的再折疊過(guò)程中由于缺乏輔助折疊的蛋白和酶，同時(shí)還會(huì)受到聚集反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)，在折疊過(guò)程中會(huì)存在某些能壘，阻礙蛋白形成最穩(wěn)定的分子構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白處于可能的穩(wěn)定狀態(tài)。

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