王喜軍，堵 芳，馬 君，王 挺，盛曉楓，劉 毅，劉 偉

（1.湖南省長(zhǎng)沙市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，長(zhǎng)沙 410013；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

·簡(jiǎn)報(bào)·

長(zhǎng)沙市野生態(tài)動(dòng)物園斑馬蜱pcox1基因擴(kuò)增及序列分析

王喜軍1,2，堵 芳1，馬 君1，王 挺1，盛曉楓1，劉 毅1，劉 偉1

（1.湖南省長(zhǎng)沙市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，長(zhǎng)沙 410013；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

為研究長(zhǎng)沙市生態(tài)動(dòng)物園引進(jìn)的非洲肯尼亞斑馬蜱的線(xiàn)粒體DNA的部分細(xì)胞色素C氧化酶第Ⅰ亞基（cytochrome coxidase subunit l，pcox1）基因序列的遺傳變異情況，本研究對(duì)其線(xiàn)粒體pcox1基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并使用DNAStar（V5.01）、Clustalx2.0及Phylip3.67進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，幾種斑馬蜱為消色牛蜱、麗色扇頭蜱和璃眼蜱屬，種間差異為0.7%～20.2%，種內(nèi)相似度較高，表明pcox1基因可作為蜱種間遺傳變異研究的標(biāo)記，研究結(jié)果為蜱的分類(lèi)鑒定以及進(jìn)一步的分子流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

斑馬；蜱；pcox1；序列分析

蜱屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)（Arthropoda）、蛛形綱（Arachnida）、蜱螨亞綱（Acari）、寄螨目（Parasitiformes）、蜱總科（Ixodoidea），為專(zhuān)性體外吸血的節(jié)肢動(dòng)物，是一類(lèi)陸生脊椎動(dòng)物非永久性體外寄生蟲(chóng)，在昆蟲(chóng)學(xué)、寄生蟲(chóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)上具有重要的地位[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界蜱總共約899種，其中約有700多種屬于硬蜱科，約150種為軟蜱[2]。蜱以吸食血液為生，除卵外，每個(gè)發(fā)育時(shí)期的進(jìn)一步發(fā)育都必須先吸飽血[3]。蜱在自然界廣泛分布于各類(lèi)森林、草原、農(nóng)田和灌叢，種群數(shù)量取決于宿主的數(shù)量及生態(tài)環(huán)境條件[4]。蜱是許多人畜共患疾病的病原體傳播媒介和宿主。蜱所攜帶的病原體不僅能夠傳播疾病，多數(shù)情況下還能經(jīng)卵遺傳給后代。同時(shí)，蜱在動(dòng)物界普遍寄生，經(jīng)常更換宿主。因此，蜱可以在許多動(dòng)物中傳染疾病，并將野生動(dòng)物或家畜體內(nèi)的病原體經(jīng)血、淋巴道傳染給人類(lèi)[5]。在所有能夠傳染疾病的媒介生物類(lèi)型中，蜱傳播疾病的能力僅次于蚊類(lèi)[6]。

目前已報(bào)道我國(guó)的蜱可傳播14種細(xì)菌、32種原蟲(chóng)、126種病毒、18種螺旋體、18種立克次體和一些支原體、衣原體，并分泌毒素[7]。世界上約10%的蜱攜帶病原體，被這種蜱叮咬后，在特定環(huán)境下將引起人、動(dòng)物疾病和地方性人畜共患?。ㄈ绯鲅獰?、萊姆病、無(wú)形體病、森林腦炎、蜱媒斑疹熱、Q熱、巴貝西蟲(chóng)病、豬瘟及蜱癱等）。國(guó)內(nèi)外已有幾例蜱傳播疾病感染導(dǎo)致神經(jīng)損害的病例[8]。2010年我國(guó)河南省商城縣爆發(fā)多起蜱叮咬人致死事件，引起人們對(duì)蜱的廣泛關(guān)注，深入研究蜱的基因序列對(duì)控制和消滅蜱傳播的多種疾病具有重要的意義。

線(xiàn)粒體DNA部分細(xì)胞色素C氧化酶第Ⅰ亞基（cytochrome c oxidase subunit 1，pcox1）基因是核基因組以外的線(xiàn)粒體基因組基因，不帶重組遺傳，因而每一個(gè)序列都是一個(gè)單模標(biāo)本[9]。pcox1以母系遺傳為主，進(jìn)化速度快，無(wú)雙親遺傳的遺傳差異，且不受基因重組、易位等畸變影響，也無(wú)核基因中那種功能不清的片段。與核基因相比，線(xiàn)粒體基因的進(jìn)化方式相對(duì)簡(jiǎn)捷，是研究分子進(jìn)化的有價(jià)值的基因[10]。本研究通過(guò)對(duì)斑馬蜱線(xiàn)粒體DNA pcox1進(jìn)行序列分析，為種群遺傳變異及進(jìn)一步分子遺傳學(xué)和診斷學(xué)提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)體樣品樣品采自于長(zhǎng)沙市生態(tài)動(dòng)物園2010年7月從非洲肯尼亞引進(jìn)的斑馬（表1），各蜱樣品外觀形態(tài)見(jiàn)圖1。

表1 本研究中蜱樣品代碼Table 1 Sample code of ticks in this study

圖1 蜱樣品外觀形態(tài)Fig.1 The ventral and dorsal view of ticks

A: 消色牛蜱(BMP2); B: 麗色扇頭蜱(BMP5); C: 麗色扇頭蜱(BMP6); D: 璃眼蜱(BMP8)

A: Boophilus decoloratus (BMP2); B: Rhipicephalus pulchellu (BMP5); C: Rhipicephalus pulchellu (BMP6); D: Hyalomma(BMP8)

1.2 主要試劑WizardTM DNA Clean-Up System為Promega公司產(chǎn)品；Ex Taq酶、PCR試劑、DNA

Marker DL 2000為T(mén)aKaRa寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；蛋白酶K為Merck公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 蟲(chóng)體DNA的提取 取滅菌且經(jīng)過(guò)紫外燈照射過(guò)的眼科剪將蜱組織剪碎，加入Nucleic Lysis Solution裂解緩沖液200 μL，混勻；然后加入30 μL蛋白酶K (50 μg/μL)，對(duì)于飽血蜱蟲(chóng)蛋白酶K使用量加倍，可達(dá)50 μL；蓋緊蓋子于震蕩儀上混勻， 56℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，其間數(shù)次不定時(shí)的搖動(dòng)，使蜱組織與裂解液、蛋白酶K充分接觸并裂解。消化好的蟲(chóng)體懸液按Genomic DNA mini kit使用說(shuō)明提取蟲(chóng)體DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增 采用Chitimia等[11]報(bào)道的引物：pcox1F: 5′-GGAACAATATATTTAATTTTTG-3′(23bp)，pcox1R: 5′-ATCTATCCCTACTGT AAATATATG-3′（24bp）。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。擴(kuò)增體系為25 μL：滅菌水l4.25 μL、10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL、MgC12（25 mmol/L）4 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、上游引物（100 pmol/L）0.5 μL、下游引物（100 pmol/L）0.5 μL、Taqpolymerase（5 U/L）0.25 μL、DNA模板l μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.3.3 pcox1序列測(cè)定及其在種系發(fā)育分析中的應(yīng)用 將純化后的PCR產(chǎn)物送華大基因生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar 5.0軟件進(jìn)行分析。從GenBankTM檢索代表性的蜱pcox1序列，然后與之進(jìn)行相似性比對(duì)和蜱種系發(fā)育分析，以豬蛔蟲(chóng)WQ為外群。利用Clustalx2.0及Phylip3.67軟件對(duì)獲得蜱pcox1序列進(jìn)行比對(duì)及計(jì)算遺傳距離。采用Mega 4.1程序中的鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果4個(gè)樣品均成功地?cái)U(kuò)增出約800 bp的片段，與預(yù)期pcox1目的片段長(zhǎng)度相符（圖2）且無(wú)非特異性條帶。

圖2 斑馬蜱pcox1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Amplifi cation of pcox1 of ticks from zebra by PCRM：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）；1～4：BMP2、BMP5、BMP6、BMP8；5：陰性對(duì)照M: DNA Marker(DL2000)；1-4: BMP2, BMP5, BMP6, BMP8; 5: Negative control

2.2 基因序列測(cè)定結(jié)果及同源分析根據(jù)測(cè)序結(jié)果，蜱pcox1序列總長(zhǎng)為732 bp。通過(guò)DNAStar（V5.01）、Clustalx2.0及Phylip3.67軟件分析，各樣品的pcox1種間差異明顯，雖然，也存在種內(nèi)差異，但大部分種內(nèi)相似度很高，麗色扇頭蜱BMP5與BMP6之間相似度為99%（圖3）。用軟件PAUP構(gòu)建的MP系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，消色牛蜱BMP2、麗色扇頭蜱BMP5和BMP6、璃眼蜱BMP8的相似性高，其中BMP5與BMP6處于同一分支上，而與豬蛔蟲(chóng)相隔較遠(yuǎn)，這一結(jié)果與序列分析結(jié)果具有一致性（圖4）。本研究首次報(bào)道了消色牛蜱和麗色扇頭蜱pcox1序列。

圖3 蜱pcox1基因序列差異性比較Fig. 3 Comparison of pcox1 sequence of ticks

圖4 pcox1基因序列以臨接法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenic tree construction based pcox1 gene using Neighbour Joining (NJ)

參考文獻(xiàn)

[1] 楊曉軍, 陳澤, 劉敬澤. 蜱類(lèi)的起源和演化[J]. 昆蟲(chóng)知識(shí), 2008, 45(1): 28-33.

[2] 徐廣, 方慶權(quán), Keirans J E, 等. 分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析的一種新方法-貝葉斯法在硬蜱屬中的應(yīng)用[J]. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2009, 49(3): 380-388.

[3] 李鷗, 王連想, 向振強(qiáng). 分子遺傳標(biāo)記與動(dòng)物分子育種研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 11: 210- 212.

[4] 程天印, 周金林. 蜱源抗凝分子及其作用機(jī)制[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004, 30(6): 583-587.

[5] 郝雪峰, 殷宏, 羅建勛. 蜱的化學(xué)和免疫學(xué)防止研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008, 29(12): 52-56.

[6] 龔海燕, 周金林, 周勇志, 等. 鐮形扇頭蜱—新基因的分離、克隆、表達(dá)和抗蜱免疫保護(hù)作用[J]. 中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)病, 2005, 13(3): 1-5.

[7] 寶福凱. 蜱傳病原體的混合感染研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué), 2007, 7(l): 112-114.

[8] 龔海燕, 周金林. 蜱對(duì)宿主免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2005, 26(4): 34-38.

[9] Avise J C. Moleuclar population structure and the biogeographick history of a regional founa: a case history with lessons for conservation biology[J]. Oikos, 1992, 63: 62-76.

[10] 張亞平. 從DNA序列到物種樹(shù)[J]. 動(dòng)物學(xué)研究, 1996, 17(3): 247-252.

[11] Chitimia L, Lin R Q, Osoroaba I, et al. Genetic characterization of ticks from southwestern Romania by sequences of mitochondrial cox1 and nad5 gene [J]. Exp Appl Acarol, 2010, 52(3): 305-311.

GENE MANIPULATION AND SEQUENCE ANALYSIS OF PCOX1 OF TICKS FROM A ZEBRA IN CHANGSHA ZOO

WANG Xi-jun1,2DU Fang1, MA Jun1, WANG Ting1, SHENG Xiao-feng1, LIU Yi1, LIU Wei1
(1. Hunan Animal Health Supervision Institute, Changsha 410013, China; 2. College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

In order to illustrate sequence variation in cytochrome c oxidase subunit l (pcox1) mtDNA of ticks collected from a Kenya zebra in Changsha Ecological Zoo, pcox1 mtDNA are amplified and analyzed using softwares DNAStar (V5.01), Clustalx2.0 and Phylip3.67. The ticks collected from a zebra were Boophilus decoloratus, Rhipicephalus pulchellu and Hyalomma with inter-species difference at 0.7%-20.2%. The pcox1 gene might be used as a marker for genetic variability.

Zebra; tick; pcox1; sequence analysis

S852.746

B

：1674-6422（2014）04-0063-04

2013-06-18

湖南省教育廳一般項(xiàng)目（11C0669）；湖南省畜牧水產(chǎn)局一般項(xiàng)目；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（DFCXY201231）；國(guó)家自然基金項(xiàng)目（30771616）

王喜軍，女，碩士研究生，獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

劉偉，E-mail：weiliupro@163.com