溫肖會(huì)，蔡春梅，魏文康，翟少倫，呂殿紅，賈春玲，袁 潔，黃 忠，周秀蓉

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣州 510640）

·研究論文·

H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因雙重RT-PCR定型檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

溫肖會(huì)，蔡春梅，魏文康，翟少倫，呂殿紅，賈春玲，袁 潔，黃 忠，周秀蓉

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣州 510640）

為了建立適用于臨床診斷的H1N1亞型豬流感病毒快速檢測(cè)方法，本研究根據(jù)GenBank已登錄的H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因序列設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物，以H1N1亞型豬流感病毒、H3N2亞型豬流感病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒為試驗(yàn)對(duì)照，通過(guò)優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，建立了H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因雙重RT-PCR定型檢測(cè)方法。同時(shí)，運(yùn)用H1N1亞型豬流感病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)方法和本研究建立的方法對(duì)165份豬病料樣品進(jìn)行了對(duì)比驗(yàn)證。結(jié)果表明，本研究建立的H1N1亞型豬流感病毒雙重RT-PCR具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性，所擴(kuò)增的目的基因片段大小分別為428 bp和678 bp左右，可檢出最小基因組RNA濃度為2.9×10-5μg/μL。本研究建立的方法和H1N1亞型豬流感病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)方法均從同一份豬肺臟樣品中檢測(cè)出H1N1亞型豬流感病毒，其余樣品中均未檢出H1N1亞型豬流感病毒，兩種方法符合率為100%。本研究建立的方法適用于H1N1亞型豬流感病毒雙基因定型檢測(cè)，可在H1N1亞型豬流感病毒流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷中應(yīng)用。

H1N1亞型豬流感；雙重RT-PCR方法；HA基因；NA基因

流感病毒（Influenza virus，IV）屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）、流感病毒屬，根據(jù)核衣殼蛋白（Nucleotide protein，NP）和基質(zhì)蛋白（Martrix proteins，M）不同，分為甲（A）、乙（B）、丙（C）3型[1]。2009年一種新型甲型HlNl流感病毒在墨西哥暴發(fā)流行，隨后傳播至全球大多數(shù)國(guó)家，包括美國(guó)、加拿大、澳大利亞、阿根廷、巴西、中國(guó)等國(guó)家[2-6]。該病毒屬正粘病毒科甲型豬源性流感病毒屬，為單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒，其基因組的神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）、M節(jié)段為歐亞譜系，與已知的三重配甲型豬源性流感病毒（NA、M節(jié)段為北美譜系）不同[7]。血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）決定著甲型流感病毒的亞型，通過(guò)HA和NA的不同組合，有16種HA亞型（Hl～H16）和9種NA亞型（N1～N9）[8]。HA可被宿主細(xì)胞表面含唾液酸的蛋白質(zhì)識(shí)別并介導(dǎo)病毒入侵，內(nèi)吞后觸發(fā)病毒與宿主細(xì)胞膜融合，病毒RNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；NA通過(guò)裂解宿主和病毒蛋白上的唾液酸，以便于病毒脫離細(xì)胞[9,10]。HA基因和NA基因在流感病毒入侵與脫離細(xì)胞中起著重要的作用，選用HA和NA作為被檢抗原來(lái)檢測(cè)H1N1豬流感病毒較為及時(shí)、可靠，因此雙基因定型檢測(cè)方法尤為重要。本研究針對(duì)H1N1豬流感病毒HA和NA基因建立了雙重RT-PCR定型性檢測(cè)方法，以便能更好地為H1N1豬流感流行病學(xué)調(diào)查和防控工作提供可靠的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與待檢樣品 H1N1亞型豬流感病毒、H3N2亞型豬流感病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所動(dòng)物疫病診斷中心保存；待檢樣品：2009年6月至2012年6月，分別從廣州市、東莞市、增城市、惠州市、中山市、博羅縣、江門(mén)市等10個(gè)市（縣）的80個(gè)病死豬中采集到的165份豬病料樣品，包括肺臟80份、淋巴結(jié)30份、脾臟30份以及腎臟25份，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所動(dòng)物疫病診斷中心保存。

1.1.2 主要試劑和工具酶 一步法反轉(zhuǎn)錄RT-PCR試劑盒、DNA Marker (DL2000)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase -Inibitor、rTaq DNA 聚合酶、dNTPs等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；病毒基因組RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 美國(guó)伯樂(lè)公司的S1000梯度PCR儀；上海天能科技有限公司的1600凝膠成像系統(tǒng)和EPS-300電泳儀；美國(guó)貝克曼公司的DU730核酸分析儀；瑞士梅特勒-托力多儀器有限公司的AC204電子天平；德國(guó) Eppendorf公司的移液器；德國(guó)賀利氏公司的PIC017離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank 已公布的H1N1亞型豬流感病毒HA基因和NA基因的序列（登錄號(hào)：JN375137.1、JX963605.1、JQ319648.1、CY085886.1、KF142495.2、FJ536762.1、HQ541672.1、JN375195.1、JN809186.1、JX963606.1、CY085952.1、FJ536812.1、HM754650.1、JN375193.1），用 Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)H1N1亞型豬流感病毒HA基因和NA基因特異性引物，用于H1N1亞型豬流感病毒HA基因和NA基因擴(kuò)增。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約為428 bp和678 bp。HA基因擴(kuò)增引物：H1N1HAP1: 5'-CAAAGTGCCAAACTCCTC-3'；H1N1HAP2: 5'-CCATACATCCAAAAATCC-3'。NA 基因擴(kuò)增引物：H1N1NAP1: 5'-TAAGGAC AGAAGCCCATA-3'；H1N1NAP2: 5'-CAAATCATC TCAAAACCC-3'。以上引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 模板制備 按照天根生化科技有限公司病毒基因組RNA提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，提取病毒基因組RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RTPCR擴(kuò)增體系 在 PCR 反應(yīng)管中分別加入滅菌水7.5 μL，2×1 step buffer 12.5 μL、HA基因上下游引物（20 pmol/μL）各0.5 μL、NA基因上下游引物（20 pmol/μL）各0.5 μL、primescript 1 step enzyme mix 1 μL、模板 2 μL，PCR擴(kuò)增體系共25 μL 。

1.2.4 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化 運(yùn)用正交法梯度性地改變變性溫度和時(shí)間，退火溫度和時(shí)間、延伸時(shí)間以及循環(huán)數(shù)等條件，確定引物的最佳循環(huán)擴(kuò)增條件。

1.2.5 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因序列測(cè)定取H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因PCR 產(chǎn)物 50 μL 于1.2% 瓊脂糖凝膠上電泳，切下目的條帶，按凝膠回收試劑盒操作說(shuō)明純化回收 PCR 產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物送上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果分別與GenBank 網(wǎng)站公布的H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因參考序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.6 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR擴(kuò)增特異性試驗(yàn) 以H1N1亞型豬流感病毒、H3N2亞型豬流感病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒提取的基因組RNA為模板，并以滅菌水為陰性對(duì)照，驗(yàn)證該RT-PCR方法的特異性。

1.2.7 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR擴(kuò)增敏感性試驗(yàn) 將 200μL H1N1亞型豬流感病毒提取基因組RNA，用核酸分析儀確定其濃度，然后將其按 10倍遞減稀釋至 10-8，用引物對(duì)其進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證該RT-PCR方法的敏感性。

1.2.8 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR擴(kuò)增重復(fù)性試驗(yàn) 將H1N1亞型豬流感病毒在相同條件下，重復(fù)進(jìn)行 8次基因組RNA提取和RT-PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證該RT-PCR方法的重復(fù)性。

1.2.9 臨床應(yīng)用檢測(cè) 將165份豬病料樣品無(wú)菌研磨處理后，過(guò)濾，接種雞胚分離培養(yǎng)，盲傳3代，用H1N1亞型豬流感標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)3批雞胚尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)鑒定。通過(guò)運(yùn)用H1N1亞型豬流感病毒雞胚分離鑒定、血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)與本研究建立的H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR定型檢測(cè)方法對(duì)165份豬病料樣品進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，了解165份豬病料樣品中H1N1亞型豬流感病毒的陽(yáng)性率，并比較H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR定型檢測(cè)方法和病毒分離鑒定方法的符合率，以驗(yàn)證H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR定型檢測(cè)方法的實(shí)用性與準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR反應(yīng)條件及擴(kuò)增最佳循環(huán)擴(kuò)增條件為：首先50℃ 45 min；95℃預(yù)變性 5 min；然后95℃變性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸90 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳顯示，單純HA基因引物、NA基因引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物分別在428 bp和678 bp左右各出現(xiàn)了1條片段，HA和NA 基因雙重引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)了2條帶，分別在428 bp和678 bp左右，與預(yù)期大小相符（圖1）。

圖1 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR result of HA gene and NA gene of H1N1 subtype Swine infl uenza virusM: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）;1: HA基因; 2: NA基因;3: HA基因和NA 基因M: DNA Marker(DL2000); 1: HA gene; 2: NA gene; 3: HA and NA gene

2.2 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因測(cè)序?qū)A基因和NA基因引物擴(kuò)增到的基因片段測(cè)序，序列測(cè)定結(jié)果提交NCBI BLAST進(jìn)行比對(duì)檢索，鑒定為H1N1亞型豬流感病毒HA基因和NA基因，結(jié)果表明，HA基因和NA基因引物能分別準(zhǔn)確擴(kuò)增到H1N1亞型豬流感病毒HA基因和NA基因序列。

2.3 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR擴(kuò)增特異性試驗(yàn)經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳顯示，發(fā)現(xiàn)只有H1N1亞型豬流感病毒PCR產(chǎn)物在428 bp和678 bp左右各出現(xiàn)了一條目的片段，與預(yù)期大小相符，而滅菌水對(duì)照、H3N2亞型豬流感病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒都沒(méi)有出現(xiàn)條帶（圖2）。

圖2 RT-PCR檢測(cè)H1N1亞型豬流感病毒特異性試驗(yàn)Fig.2 Specifi city test of RT-PCR for H1N1 subtype Swine infl uenza virus

M: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: H1N1亞型豬流感病毒; 2:陰性對(duì)照; 3: H3N2亞型豬流感病毒; 4: 豬瘟病毒; 5: 豬繁殖與呼吸綜合征病毒

M: DNA Marker (DL2000); 1: H1N1 subtype Swine infl uenza virus; 2: Negative control; 3: H3N2 subtype Swine infl uenza virus; 4: Classical Swine fever virus; 5: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

2.4 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR擴(kuò)增敏感性試驗(yàn)用核酸測(cè)定儀測(cè)定H1N1亞型豬流感病毒基因組RNA的濃度為2896 μg/mL，OD260與OD280的比值為2.08，按10倍遞減稀釋至2.9×10-8μg/mL，PCR擴(kuò)增體系為 25 μL，模板為2 μL。能檢出的最小基因組RNA濃度為2.9×10-5μg/μL（圖3）。

2.5 H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR擴(kuò)增重復(fù)性試驗(yàn)經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳顯示，8次提取的H1N1亞型豬流感病毒基因組RNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果均出現(xiàn)了清晰明亮的目的條帶（圖4）。結(jié)果表明，建立的H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RTPCR定型檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床應(yīng)用檢測(cè)165份豬病料樣品雞胚分離鑒定結(jié)果顯示，1份肺臟樣品在48 h內(nèi)導(dǎo)致雞胚全身出血死亡，尿囊液渾濁，血凝價(jià)為9 log2，H1N1亞型豬流感標(biāo)準(zhǔn)血清血凝抑制價(jià)為8 log2，鑒定為H1N1亞型豬流感病毒；其余164份樣品雞胚在72 h時(shí)血管清晰、尿囊液澄清，生長(zhǎng)良好，無(wú)死亡雞胚，均無(wú)血凝性。雞胚分離鑒定結(jié)果表明，從165份豬病料樣品中分離到一株H1N1亞型豬流感病毒。RT-PCR定型檢測(cè)結(jié)果顯示，雞胚分離鑒定H1N1亞型豬流感病毒陽(yáng)性肺臟樣品在428 bp和678 bp左右各出現(xiàn)了一條特異性的目的片段，其余肺臟、淋巴結(jié)、脾臟和腎臟等164份樣品均沒(méi)有出現(xiàn)條帶，表明165份豬病料樣品中檢出1份H1N1豬流感病毒核酸陽(yáng)性樣品。兩種方法對(duì)比驗(yàn)證結(jié)果表明，雞胚分離鑒定方法和本研究建立的H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RTPCR定型檢測(cè)方法符合率為100%，驗(yàn)證了本研究建立的H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR定型檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

圖3 RT-PCR檢測(cè)H1N1亞型豬流感病毒敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of RT-PCR for H1N1 subtype Swine infl uenza virus

M: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: 2.9×10-1μg/μL; 2: 2.9×10-2μg/μL; 3: 2.9×10-3μg/μL; 4: 2.9×10-4μg/μL; 5: 2.9×10-5μg/μL; 6: 2.9×10-6μg/μL; 7: 2.9×10-7μg/μL; 8: 2.9×10-8μg/μL

M: DNA Marker (DL2000); 1: 2.9×10-1μg/μL; 2: 2.9×10-2μg/μL; 3: 2.9×10-3μg/μL; 4: 2.9×10-4μg/μL; 5: 2.9×10-5μg/μL; 6: 2.9×10-6μg/μL; 7: 2.9×10-7μg/μL; 8: 2.9×10-8μg/μL

圖4 RT-PCR檢測(cè)H1N1亞型豬流感病毒重復(fù)性試驗(yàn)Fig.4 Repeatability test of RT-PCR for H1N1 subtype Swine infl uenza virusM: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1～8: 依次是第1到8次提取的H1N1亞型豬流感病毒基因組RNAM: DNA Marker (DL2000); 1-8: RNA extraction from H1N1 subtype Swine infl uenza virus

3 討論

豬在流感病毒種屬間互相傳播中占有重要的地位，被認(rèn)為是人、禽、豬流感病毒通過(guò)基因重排產(chǎn)生新型流感病毒的“混合器”。人呼吸道上皮細(xì)胞主要以唾液酸α-2,6半乳糖苷（SA-α-2，6Gal）受體為主，而禽呼吸道上皮細(xì)胞主要以唾液酸α-2,3半乳糖苷（SA-α-2,3Gal）受體為主。因此，禽流感病毒主要與SA-α-2,3Gal受體結(jié)合，而人流感病毒主要與SA-α-2,6Gal受體結(jié)合。豬呼吸道上皮細(xì)胞表面既有SA-α-2,3Gal受體又有A-α-2,6Ga1受體，因此豬作為中間宿主能同時(shí)被禽流感病毒、人流感病毒和豬流感病毒共同感染，三者既可能發(fā)生基因重配，也可能使禽流感病毒獲得哺乳動(dòng)物病毒細(xì)胞受體識(shí)別的分子，可能出現(xiàn)能夠適應(yīng)人和哺乳動(dòng)物的新型重組流感病毒毒株[11]。豬流感與人流感密切相關(guān)，引起人類歷史上3次流感大暴發(fā)的病原H1N1、H2N2和H3N2亞型流感病毒，均由當(dāng)時(shí)存在于禽類的流感病毒和人的流感病毒在豬體內(nèi)重組和突變而來(lái)[12]。一直以來(lái)，作為養(yǎng)豬大國(guó)，我國(guó)豬流感病毒是影響?zhàn)B殖業(yè)健康發(fā)展的一種重要病原，尤其是H1N1亞型豬流感在我國(guó)豬群中普遍存在并不斷發(fā)病，不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了極大的危害，還嚴(yán)重危害人類健康，有重要的公共衛(wèi)生意義。因此，基于豬在流感病毒傳播鏈中的作用以及我國(guó)流感病毒生態(tài)學(xué)的復(fù)雜性，必須加強(qiáng)檢測(cè)工作，尋求豬流感的快速、可靠、適用于臨床檢測(cè)的檢測(cè)方法，才能充分了解豬群中流感病毒的流行毒株和分布情況。

近幾年來(lái)，豬流感的檢測(cè)工作受到高度重視，促使豬流感的檢測(cè)方法得到較好的發(fā)展。歐陽(yáng)振宇等[13]建立了A型豬流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，使用含有選定檢測(cè)序列的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法的敏感性可達(dá)100拷貝/25 μL，顯示出良好的敏感性和重復(fù)性，臨床上已用于實(shí)驗(yàn)室鼻拭子樣品的檢測(cè)。楊煥良等[14]建立了豬流感H1Nl、H1N2和H3N2亞型病毒多重RT-PCR診斷方法，最少可檢測(cè)到102ElD50的病毒量核酸。對(duì)40份陽(yáng)性臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果和雞胚分離病毒結(jié)果100%一致。2009年北美暴發(fā)的甲型H1N1流感感染人的事件再次提醒我們要密切關(guān)注豬流感對(duì)社會(huì)公共衛(wèi)生的威脅。張紅娜等[15]從山東省9個(gè)地市40個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)采集有流感癥狀豬的血液樣品（263份）和鼻咽拭子（235份），分別用HI試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)血清抗體滴度和熒光定量PCR術(shù)檢測(cè)鼻咽拭子中的流感病毒的含量，對(duì)豬源新型甲型流感病毒的感染情況進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果表明，血清總陽(yáng)性率為41.6%，熒光定量PCR檢測(cè)鼻咽拭子總陽(yáng)性率為30.36%。表明山東省H1N1豬流感分布廣泛，在各個(gè)地市都有嚴(yán)重的H1N1亞型豬流感感染和流行。白昀等[16]于2011年2月～5月間從江蘇省南京市某屠宰場(chǎng)的健康豬群中采集鼻拭子和肺臟組織共690份，通過(guò) RT-PCR 檢測(cè)有 18 份樣品為H1N1亞型豬流感陽(yáng)性，陽(yáng)性率為2.61%，表明南京市健康豬群中存在H1N1亞型豬流感帶毒情況。禹思宇等[17]于2010年6月采用間接ELISA和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR對(duì)湖南省規(guī)模化豬場(chǎng)采集的1065份豬血清、16 796份豬棉拭子和360份肺臟樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明H1NI豬流感在湖南省呈普遍感染態(tài)勢(shì)。

建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、適合臨床應(yīng)用的H1N1亞型豬流感檢測(cè)方法對(duì)H1N1亞型豬流感進(jìn)行監(jiān)測(cè)和調(diào)查十分必要，快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法是及時(shí)發(fā)現(xiàn)、控制和撲滅H1N1亞型豬流感疫情的重要前提和手段。本研究根據(jù)GenBank已登錄的H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因序列設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物，成功建立了H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因雙基因定型檢測(cè)方法。試驗(yàn)證實(shí)，該方法具有良好的特異性、重復(fù)性、敏感性，H1N1亞型豬流感病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)方法和本研究建立的方法均從同一份肺臟樣品中檢測(cè)出H1N1亞型豬流感病毒，其余樣品中均未檢出H1N1亞型豬流感病毒，兩種方法符合率為100%，驗(yàn)證了本研究建立的H1N1亞型豬流感病毒HA和NA基因RT-PCR定型檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。該方法適用于H1N1亞型豬流感病毒一次性定型檢測(cè)，可在H1N1亞型豬流感病毒流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷中應(yīng)用。

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DOUBLE RT-PCR METHODS FOR DETECTION OF HA AND NA GENES OF H1N1 SUBTYPE SWINE INFLUENZA VIRUS

WEN Xiao-hui, CAI Chun-mei, WEI Wen-kang, ZHAI Shao-lun, LV Dian-hong, JIA Chun-ling, YUAN Jie, HUANG Zhong, ZHOU Xiu-rong
(Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong 510640, China)

To develop a reliable diagnostic method for H1N1 subtype Swine infl uenza virus, double RT-PCR methods were developed using primers designed according to the sequences of HA and NA genes of H1N1 Subtype swine influenza virus in GenBank. The amplifi ed gene fragments were 428 bp for HA and 678 bp for NA. The reaction conditions were optimized and minimal detectable RNA concentration was 2.9×10-5μg/μL. Meanwhile, the method had no reaction with H3N2 subtype Swine infl uenza virus, classical Swine fever virus and Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. This method developed here is suitable for double gene typing detection and also for early diagnosis and epidemiological investigation of H1N1 subtype Swine infl uenza virus.

H1N1 subtype Swine infl uenza virus; double RT-PCR; HA gene; NA gene

S852.659.5

：A

：1674-6422（2014）04-0029-06

2013-12-20

廣東省科技計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2010B080701024）；廣東省科技計(jì)劃特定任務(wù)項(xiàng)目（2011B060700075）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012224-26）

溫肖會(huì)，女，碩士，助理研究員，主要從事動(dòng)物疫病診斷和動(dòng)物傳染病學(xué)研究

魏文康，E-mail：wwk188@tom.com