張可煜，李素梅，王霄旸，費(fèi)陳忠，王春梅，薛飛群，李 濤

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評(píng)價(jià)與殘留研究重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

·研究論文·

大鼠糞便中抗球蟲新藥沙咪珠利的HPLC檢測方法研究

張可煜，李素梅，王霄旸，費(fèi)陳忠，王春梅，薛飛群，李 濤

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評(píng)價(jià)與殘留研究重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

為研究抗球蟲新化合物沙咪珠利在大鼠糞便中的排泄情況和物料平衡規(guī)律，建立檢測大鼠糞便中沙咪珠利含量的高效液相色譜法，大鼠糞便經(jīng)乙酸乙酯提取，過MAX固相凈化小柱后上樣，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，經(jīng)C18色譜柱分離，251 nm波長紫外檢測器檢測。結(jié)果表明：該方法在20～400 μg/g添加濃度范圍內(nèi)檢測糞便中的沙咪珠利具有很好的線性關(guān)系（R2=0.995）；平均回收率為74%～117%，日內(nèi)變異系數(shù)為3.2%～11.5%，日間變異系數(shù)為6.6 %～16.3 %，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性良好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，能初步滿足糞便中沙咪珠利的檢測需求。大鼠一次性經(jīng)口灌服沙咪珠利后，約有60%通過糞便以原型形式排泄。

抗球蟲新藥；沙咪珠利；高效液相色譜；大鼠糞便；檢測

雞球蟲?。–occidiosis）是由艾美耳屬（Eimeria）的多種球蟲寄生于雞消化道引起感染的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的原蟲病，目前該病的防治主要依靠聚醚類、磺胺類、三嗪類等藥物[1-3]。然而，當(dāng)前臨床上球蟲耐藥性普遍，即使是最有效的地克珠利（Diclazuril）和妥曲珠利（Toltrazuril）等三嗪類藥物也由于長期使用而導(dǎo)致非常嚴(yán)重的耐藥性問題[3-6]。球蟲病的防治效果越來越差的現(xiàn)狀迫使人們尋求安全、高效、無交叉耐藥的新型抗球蟲藥物以應(yīng)對這一局面[3,6]。

沙咪珠利（Ethanamizuril）是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所設(shè)計(jì)合成的新型結(jié)構(gòu)三嗪類化合物。已有的研究結(jié)果顯示，該藥5 mg/kg添加劑量就具有良好的抗球蟲效果，9 mg/kg以上添加劑量其抗球蟲指數(shù)（ACI）穩(wěn)定在185～200之間，屬于高效抗球蟲藥物。此外，沙咪珠利與地克珠利、妥曲珠利等其他三嗪類化合物無交叉耐藥現(xiàn)象，并且無致畸、致癌、致突變作用，具有安全性好、毒副作用低、抗球蟲效果好等特點(diǎn)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景[7]。但是，作為國家一類新獸藥開發(fā)的沙咪珠利，其作用機(jī)理、代謝特征目前仍無相關(guān)研究報(bào)道。對藥物的代謝特征進(jìn)行研究具有重要意義，高效液相法研究藥物的代謝平衡可避免放射標(biāo)記法成本高、需要特殊儀器設(shè)備等缺點(diǎn)。本研究利用高效液相色譜建立沙咪珠利在大鼠糞便中的檢測方法，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究沙咪珠利通過糞便排泄的消除規(guī)律，為沙咪珠利的抗球蟲作用機(jī)制研究、體內(nèi)代謝平衡研究和指導(dǎo)臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器Waters 2690高效液相色譜儀為美國Waters公司產(chǎn)品；Waters 2487檢測器為美國Waters公司產(chǎn)品；MAX固相提取小柱為美國Waters公司產(chǎn)品；氮吹儀為美國organomation Associates公司產(chǎn)品；Micro CL 17/21離心機(jī)為美國Thermo公司產(chǎn)品；XW-OA型渦旋混合器為上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠產(chǎn)品；AE240雙量程分析天平為梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；超純水系統(tǒng)購自上海瑞楓生物科技有限公司。

1.2 藥品、試劑和動(dòng)物沙咪珠利對照品（含量≥99.8%），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物藥學(xué)研究室制備；乙酸乙酯、氨水、二甲基亞砜、甲酸、甲醇等試劑均為分析醇，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜純乙腈購自Fisher公司。其他試劑均為分析純。文中所用水均為超純水。SD大鼠購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2008-0016）。

1.3 工作液的配制稱取0.500 g 沙咪珠利對照品置于25 mL容量瓶中，用二甲基亞砜溶解配成20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用二甲基亞砜分別稀釋成4、10、20、40、80、200、400 μg/mL 系列濃度工作液，置于4℃冰箱中密封保存。

1.4 樣品的前處理稱取1.00 g烘干的糞便加4 mL水充分渦旋、超聲并稀釋成糞漿，加入15 mL的乙酸乙酯，渦動(dòng)1 min，300 r/min振蕩30 min，超聲15 min，4℃、12 000×g離心10 min，取2 mL上清置于另一離心管中，于40℃水浴下氮?dú)獯蹈伞４蹈珊髽悠酚?% 氨水（含40% 甲醇）1 mL復(fù)溶后上MAX固相提取小柱。

MAX固相提取小柱凈化步驟：2 mL甲醇活化→2 mL水平衡→上樣→2 mL 5%氨水→2 mL甲醇→2 mL 2%甲酸（40%甲醇）清洗→2 mL 2%甲酸（80%甲醇）洗脫→60℃氮?dú)獯蹈伞?0%甲醇水復(fù)溶→0.22 μm濾膜過濾后上HPLC測定。

1.5 色譜條件的確定及方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 色譜條件的確定 Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫為25℃，流速為1.0 mL/ min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測波長為251 nm。采用流動(dòng)相A（乙腈，V/V）和B（0.1%甲酸水）的梯度洗脫方式，即：0～6 min時(shí)，A相 5%～45%；6.01～13 min時(shí)，A相45%～45%；13.01～15 min時(shí)，A相45%～80%；15.01～25 min時(shí)，A相80%～5%。

1.5.2 方法專屬性 取干燥后空白大鼠糞便以及空白大鼠糞便加標(biāo)樣品分別按1.4處理，在上述HPLC條件下進(jìn)行測定，同時(shí)測定沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)品溶液，記錄色譜圖。

1.5.3 定量限和檢測限的確定 取4、10、20、40、80、200、400 μg/mL 沙咪珠利系列濃度工作溶液，分別各加100 μL至1.00 g烘干的空白糞便中，按照1.4樣品提取和純化方法進(jìn)行前處理，并在1.5.1中HPLC條件下進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以檢出的目標(biāo)峰峰高為10倍基線噪音值時(shí)所對應(yīng)的溶液濃度為該方法的定量限濃度，以檢出的目標(biāo)峰峰高為3倍基線噪音值時(shí)所對應(yīng)的溶液濃度為該方法的檢測限濃度。

1.5.4 線性關(guān)系 分別將20、40、80、200、400 μg/ mL 沙咪珠利系列濃度溶液100 μL加至1.00 g烘干的空白糞便中，按照1.4所述進(jìn)行前處理，在1.5.1中HPLC條件下進(jìn)行測定，每個(gè)濃度點(diǎn)做5個(gè)平行，根據(jù)色譜峰面積和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，確定回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.5.5 精密度和回收率測定 在干燥的空白糞便中分別按低、中、高3個(gè)添加濃度添加沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，使糞便中沙咪珠利的終濃度分別為4、20、40 μg/g，按照1.4所述進(jìn)行前處理，在1.5.1中HPLC條件下進(jìn)行測定，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，計(jì)算沙咪珠利在糞便中的回收率，計(jì)算沙咪珠利的日內(nèi)變異系數(shù)。此外，采用相同的方法連續(xù)3日每日重復(fù)1次，共3次，計(jì)算沙咪珠利的日間變異系數(shù)。

1.6 沙咪珠利經(jīng)大鼠糞便排泄的規(guī)律選取體重280～320 g的SD 大鼠，將沙咪珠利分散于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，充分混勻后，按照1mg/kg·bw推薦劑量經(jīng)口灌服大鼠。置動(dòng)物于代謝籠，收集0～24 h、24～48 h、48～72 h、72～96 h、96～120 h、120～144 h各時(shí)段的動(dòng)物糞便和尿液。糞便充分烘干至恒重后稱重并作記錄，尿液記錄體積，并于-20℃保存以備測驗(yàn)。

采用上述建立的樣品前處理方法和液相色譜檢測方法，檢測并計(jì)算各時(shí)段大鼠糞便和尿液中的沙咪珠利含量。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白大鼠糞便對照組與空白糞便加標(biāo)樣試驗(yàn)組色譜圖，如圖1所示。結(jié)果顯示本方法對糞便中的沙咪珠利分離良好，出峰時(shí)間為11.6 min，無雜質(zhì)干擾，專屬性良好。同時(shí)，與對照組相比較，試驗(yàn)組色譜圖未發(fā)現(xiàn)糞便中存在代謝產(chǎn)物。

圖1 大鼠糞便中沙咪珠利含量檢測的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the determination of Ethanamizuril in rat feces

A: 流動(dòng)相; B: 4 μg/mL沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液; C: 空白大鼠糞便; D: 添加沙咪珠利的大鼠糞便(40μg/g); 1: 沙咪珠利

A: The mobile phase; B: 4 μg/mL Ethanamizuril standard solution; C: Blank rat feces; D: Rat feces adding Ethanamizuril(40μg/g); 1: Ethanamizuril

2.2 靈敏度與工作曲線滿足目標(biāo)峰峰高3倍和10倍基線噪音值所對應(yīng)的最低溶液濃度分別為0.4 μg/g糞便和2 μg/g糞便，因此，沙咪珠利在糞便中的最低檢測限和定量限分別為0.4 μg/g糞便和2 μg/g糞便。

以沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，沙咪珠利在20～400 μg/g的添加濃度范圍內(nèi)，具有較好的線性關(guān)系，線性方程為Y=5471X-4608，R2=0.995，回歸曲線和方程見圖2。

圖2 沙咪珠利在大鼠糞便中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Linear correlation of standard solution ofEthanamizuril in rat feces

表1 大鼠糞便中沙咪珠利的回收率和精密度檢測結(jié)果（n=5）Table 1 Recovery and precision results of Ethanamizuril in rat feces（n=5）

2.3 回收率及精密度大鼠糞便中添加高、中、低3個(gè)濃度沙咪珠利工作液，每個(gè)濃度平行測定5個(gè)樣品，3日內(nèi)重復(fù)3次的回收率及精密度如表1。結(jié)果顯示其回收率在74%～117%之間，日內(nèi)精密度在3.2%～11.5%之間，日間精密度在6.6 %～16.3 %之間，回收率及精密度良好，符合生物樣品的測定要求。

2.4 沙咪珠利在大鼠糞便排泄規(guī)律將收集到的不同時(shí)間段的樣品分別按照上述前處理步驟進(jìn)行處理，測得的峰面積代入上述工作曲線，計(jì)算該時(shí)間段內(nèi)大鼠糞便中沙咪珠利的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠在經(jīng)口灌服沙咪珠利后，在d 1（0～24 h）就開始逐步從糞便中排出藥物，24～48 h時(shí)段排出量達(dá)到峰值（90 μg糞便），而后逐步下降；96 h后排泄的糞便中仍有少許的沙咪珠利，高于檢測限但是已經(jīng)低于定量限（2 μg/g糞便），144 h后排泄的糞便已經(jīng)低于檢測限，各個(gè)時(shí)間段的排出的糞便的含量換算結(jié)果具體如圖3。

按照該分析方法處理所得：1 mg/kg·bw沙咪珠利經(jīng)口灌胃大鼠，0～96 h大約已經(jīng)有60%的沙咪珠利以原型藥物的形式排出體外。

圖3 沙咪珠利在大鼠糞便排泄規(guī)律曲線Fig.3 Excretion curve of Ethanamizuril in rat feces

3 討論

沙咪珠利屬三嗪類化合物，與地克珠利結(jié)構(gòu)類似，都幾乎不溶于水。沙咪珠利在甲醇中略溶，在乙腈、氯仿、乙酸乙酯中微溶。在前處理時(shí)如果采用氯仿會(huì)因?yàn)槠涿芏却?，離心后位于離心管下部，影響操作的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)室研究了甲醇、乙腈和乙酸乙酯等試劑提取飼料、血清等各種基質(zhì)中沙咪珠利的前處理方法[7]，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯具有較高的提取回收率且檢測的干擾少，適合于本研究；而乙腈提取回收率低，甲醇提取雜質(zhì)較多故不適合前處理。另外，動(dòng)物糞便含有食物中未消化的各種纖維素，消化道脫落的上皮細(xì)胞，黏膜和腸道細(xì)菌，以及消化道分泌物，其成分極其復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)明顯，對HPLC法檢測的干擾很大。雖然經(jīng)乙酸乙酯提取后能去除糞便中較大的雜質(zhì)，但是仍有很多基質(zhì)成分影響沙咪珠利的分離效果，導(dǎo)致檢測靈敏度不高。本研究采用MAX固相提取小柱進(jìn)一步凈化，不僅回收率高，而且雜質(zhì)干擾小，提高了檢測靈敏度。

大鼠經(jīng)口灌服沙咪珠利后，藥物在0～96 h已經(jīng)有近60%的藥物以原型的形式經(jīng)糞便排出體外，在144 h仍能在糞便中檢測到沙咪珠利，說明腸道不僅是沙咪珠利的主要排泄途徑，而且這個(gè)過程持續(xù)時(shí)間較長。通過比較我們可以發(fā)現(xiàn)，同類藥物，地克珠利在0～96 h經(jīng)糞便排出的原型藥物占總給藥量的92%[4,8]；妥曲珠利在0～168 h經(jīng)糞便排出的藥物量也在90%之間，尿液僅占4%左右[9]；本實(shí)驗(yàn)室研究開發(fā)的同類抗球蟲藥物納川珠利在體外肝臟代謝模型中也被證明具有較高的穩(wěn)定性[10]。沙咪珠利的排泄特征和它們非常接近，這可能是因?yàn)樽鳛橐粋€(gè)抗球蟲藥物，體內(nèi)吸收少也許會(huì)更有利于藥物在腸道保持較高的濃度，從而直接作用于盲腸等組織上寄生的球蟲，取得較好的抗球蟲效果。另外，本研究還嘗試建立了大鼠尿液中的沙咪珠利檢測方法，然而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中未能檢測到經(jīng)尿液排泄的原型藥物。這可能是由于藥物經(jīng)尿液排出的是代謝產(chǎn)物或者尿液中原型藥物含量極少的緣故。

用于藥物代謝平衡試驗(yàn)的檢測方法主要有放射性標(biāo)記法和HPLC法等，放射性標(biāo)記法的缺點(diǎn)在于化合物的標(biāo)記需要特殊設(shè)備，且價(jià)格高昂，測定過程不易區(qū)分原型藥與代謝物，而且放射性檢測系統(tǒng)對儀器的要求高，普通實(shí)驗(yàn)室不能開展此類研究[4,11]。

本研究成功建立了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠糞便中的沙咪珠利含量HPLC檢測方法，方法回收率高，高、中、低3個(gè)質(zhì)控濃度下的回收率均大于74%，日內(nèi)、日間精密度良好，符合生物樣品的測定要求，為沙咪珠利的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了穩(wěn)定、可靠又方便易操作的檢測手段，同時(shí)也為其放射性標(biāo)記研究代謝平衡提供了重要參考依據(jù)。

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DETECTION OF ETHANAMIZURIL IN RAT FECES USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

ZHANG Ke-yu, LI Su-mei, WANG Xiao-yang, FEI Chen-zhong, WANG Chun-mei, XUE Fei-qun, LI Tao
( Key Open Laboratory of Veterinary Drug Safety Evaluation and Residues Research of Chinese Academy of Agricultural Science, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

A high performance liquid chromatograph (HPLC) method was used to detect a new anticoccidial drug Ethanamizuril in rat feces post single oral administration. The fecal samples were processed with ethyl acetate prior to application to MAX cleaned column. Ethanamizuril was separated on C18 column with UV detector at 251 nm by using gradient elution and mobile phase consisting of acetonitrile - 0.1% formic acid aqueous solution. The detection was linear over the range of 20～400 μg/g and showed a good linear relationship (R2= 0.995). The average recovery of Ethanamizuril ranged from 74%～117% with RSD of 3.2%～11.5% within groups, and 6.6 %～16.3 % between groups. This assay was a rapid, sensitive, selective and reliable method for detection of Ethanamizuril in rat feces. Rats were orally gavaged with Ethanamizuril once, about 60% of which were exceted through feces in prototype form.

Anticoccidial drugs; Ethanamizuril; HPLC; rat feces; detection

S859.795

A

1674-6422（2014）04-0045-05

2014-04-08

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303038）；863 計(jì)劃（2011AA10A214）

張可煜，男，博士，助理研究員，主要從事獸醫(yī)藥理毒理學(xué)研究

薛飛群， E-mail: zcole@shvri.ac.c