熊 煒，林穎崢，魏曉鋒，郭雨燕，張 強(qiáng)，劉俊平，李 健，胡建華，黃忠榮

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203）

·研究論文·

仙臺(tái)病毒核酸快速檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

熊 煒1，林穎崢1，魏曉鋒2，郭雨燕1，張 強(qiáng)1，劉俊平1，李 健1，胡建華2，黃忠榮1

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203）

仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SeV）是一種常見(jiàn)的可引起嚙齒類(lèi)動(dòng)物呼吸道疾病的病原，感染迅速，并且隱性感染率高，一旦感染較難從鼠群中清除，從而影響動(dòng)物健康。為滿(mǎn)足對(duì)入境噬齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和野生動(dòng)物仙臺(tái)病毒快速檢測(cè)的需要，本研究針對(duì)SeV編碼基質(zhì)蛋白和融合糖蛋白基因的保守序列設(shè)計(jì)引物和熒光探針，建立了仙臺(tái)病毒RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測(cè)方法。將建立的方法應(yīng)用于仙臺(tái)病毒感染鼠不同臨床樣品和組織培養(yǎng)物的檢測(cè)，證實(shí)兩種核酸檢測(cè)方法具有良好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性，適合應(yīng)用于出入境口岸實(shí)驗(yàn)和野生噬齒類(lèi)動(dòng)物仙臺(tái)病毒疫情的快速檢測(cè)。

仙臺(tái)病毒；RT-PCR；Real-time RT-PCR；TaqMan探針

仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SeV）屬副粘病毒科、副粘病毒屬，是一種具有細(xì)胞融合活性的病毒，它可引起嚙齒類(lèi)動(dòng)物呼吸道疾病。1952年首先在日本分離到仙臺(tái)病毒，繼而世界各地都有報(bào)道[1]。仙臺(tái)病毒感染一年四季都可發(fā)生，但以春季多發(fā)，環(huán)境因素的突變可加重發(fā)病和流行?？諝鈧鞑ズ椭苯咏佑|傳播是該病毒播散的主要方式。SeV在鼠群中多呈隱性感染，實(shí)驗(yàn)用鼠一旦感染常會(huì)改變體內(nèi)細(xì)胞免疫反應(yīng)，干擾試驗(yàn)結(jié)果，而且難以從鼠群中清除該病毒，影響幼鼠發(fā)育成長(zhǎng)和降低成年母鼠的繁殖率。在自然條件下仙臺(tái)病毒可感染小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和豚鼠，不同品系小鼠對(duì)仙臺(tái)病毒的易感性明顯不同。雪貂可鼻內(nèi)感染，引起發(fā)熱、肺炎和死亡。該病毒對(duì)人類(lèi)有一定的致病性，特別是幼兒易感，日本和中國(guó)均有相關(guān)報(bào)道[2,3]。仙臺(tái)病毒為單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組大小為15 kb，編碼核殼蛋（Nucleoprotein，N）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基質(zhì)蛋白（Matrix protein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F(xiàn)）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（Hemagglutinin neuraminidase，HN）和大蛋白（L protein，L）等結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白[4-6]，已有研究將其作為基因治療和免疫的載體[7,8]。除病原分離、血清中和和ELISA等傳統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)方法，RTPCR是最常用的核酸檢測(cè)方法[9-14]。由于仙臺(tái)病毒隱性感染率高、危害大，為了加強(qiáng)出入境口岸對(duì)入境噬齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和野生動(dòng)物仙臺(tái)病毒疫病監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，本研究建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測(cè)SeV的方法，并將其應(yīng)用于不同組織和體液樣本的檢測(cè)，以測(cè)試核酸快速檢測(cè)方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；Taq酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、隨機(jī)引物、DNA Marker（DL2000）購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 病毒樣品來(lái)源及處理SeV陽(yáng)性組織和細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，采集病鼠口鼻液、血液、糞便，以及肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織器官。糞便、組織樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3000×g離心15 min，收集上清液待檢。本研究使用的其他病毒，如小鼠肺炎病毒（Pneumonia virus of mice，MPV）、鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus，MHV）、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）、呼腸孤病毒3型（Reovirus type 3，Reo-3）、小鼠細(xì)小病毒（Parvovirus minute virus of mice，MVM）來(lái)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。上述病毒樣品經(jīng)核酸分離提取制備成cDNA備用。

1.3 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)將SeV細(xì)胞培養(yǎng)物0.5 mL滴鼻感染

6周齡Swiss裸鼠，正常喂飼2～3 d，待其出現(xiàn)臨床癥狀后采集鼠的口鼻液、血液、糞便，并處死，采集肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織樣本。

1.4 RNA抽提及cDNA模板制備取100 μL待檢上清液或血清，加1 mL TRIzol試劑，按常規(guī)方法進(jìn)行RNA抽提，RNA沉淀用20 μL DEPC水溶解。取11 μL RNA溶液，加5×逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液4 μL、dNTP 1 μL、隨機(jī)引物1 μL、RNA酶抑制劑1 μL、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL，置PCR儀上42℃反應(yīng)60 min，即得cDNA模板。

1.5 RT-PCR檢測(cè)針對(duì)SeV的融合糖蛋白（fusion glycoprotein）基因設(shè)計(jì)RT-PCR引物，擴(kuò)增片段大小為507 bp。上游引物：5'-CCACATTGG TCTCGTGTCAGATTCC-3'，下游引物：5'-CATC ATTCACGAAATCCTGGAGTGTC-3'。反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL、10×Taq酶濃縮緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水補(bǔ)足總體積至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)拍攝。

1.6 Real-time RT-PCR引物和TaqMan探針使用Vector NTI Suite軟件分析不同國(guó)家和地區(qū)分離的SeV基質(zhì)蛋白（M）基因的保守序列，用Primer Express軟件設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，上游引物（TSVF）：5'-GTGATTTGGGCGGC ATCT-3'，下游引物（TSVR）：5'-GATGGCCGG TTGGAACAC-3'，TaqMan探針：5'-TAGAAATC ACAGGCGTCG-3'，其中TaqMan探針的5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記TAMRA。引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成，引物和探針的濃度均為25 μmol/L。

1.7 Real-time RT-PCR檢測(cè)采用ABI公司ViiA7熒光PCR儀。反應(yīng)體系：10×Taq酶濃縮緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、Taq酶0.25 μL、模板1 μL、上下游引物（TSVF、TSVR）各0.25 μL、TaqMan探針0.25 μL，加水補(bǔ)足總體積至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；然后95℃ 15 s，58℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)第二步收集熒光信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測(cè)SeV的特異性試驗(yàn)針對(duì)SeV保守基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針，分別建立RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測(cè)方法，并使用不同鼠病毒（MHV、MPV、LCMV、Reo-3和MVM）作為對(duì)照，測(cè)試這兩種檢測(cè)方法的特異性。結(jié)果顯示，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，僅有SeV陽(yáng)性樣品出現(xiàn)條帶單一的特異性基因擴(kuò)增，其他對(duì)照病毒樣品均呈陰性（圖1）；經(jīng)Real-time RT-PCR檢測(cè)，SeV陽(yáng)性樣品在18～20個(gè)循環(huán)處出現(xiàn)顯著擴(kuò)增，對(duì)照病毒樣品未見(jiàn)擴(kuò)增（圖2）。

圖1 RT-PCR方法檢測(cè)仙臺(tái)病毒的特異性Fig.1 The Specifi city of RT-PCR for detecting Sendai virus (SeV)M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: SeV; 2: MHV; 3: MPV; 4: LCMV; 5: Reo-3; 6: MVM; 7: 空白對(duì)照M: DNA Marker (DL2000); 1: SeV; 2: MHV; 3: MPV; 4: LCMV; 5: Reo-3; 6: MVM; 7: Blank control

圖2 Real-time RT-PCR方法檢測(cè)仙臺(tái)病毒的特異性Fig.2 The specifi cty of Real-time RT-PCR for detecting Sendai virus (SeV)

2.2 RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測(cè)SeV的敏感性試驗(yàn)將SeV陽(yáng)性樣品cDNA進(jìn)行定量并梯度稀釋?zhuān)苽錆舛确謩e為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL的模板，再分別用建立的兩種方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，常規(guī)RT-PCR檢測(cè)樣品SeV陽(yáng)性樣品cDNA模板的下限量為100～10 pg（圖3），而Real-time RT-PCR檢測(cè)SeV cDNA模板的下限量為100～10 fg（圖4）。

圖3 RT-PCR檢測(cè)仙臺(tái)病毒的敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of RT-PCR for detecting Sendai virus (SeV)

M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: 10 ng模板; 2: 1 ng模板; 3: 100 pg模板; 4: 10 pg模板; 5: 1 pg模板; 6: 100 fg模板; 7: 10 fg 模板; 8: 1 fg模板

M: DNA Marker(DL2000); 1: 10 ng template; 2: 1 ng template; 3: 100 pg template; 4: 10 pg template; 5: 1 pg template; 6: 100 fg template; 7: 10 fg template; 8: 1 fg template

圖4 Real-time RT-PCR方法檢測(cè)仙臺(tái)病毒的特敏感性試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of Real-time RT-PCR for detecting Sendai virus (SeV)

2.3 RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測(cè)SeV陽(yáng)性鼠不同臨床樣本為進(jìn)一步驗(yàn)證建立的RT-PCR和Realtime RT-PCR方法的可靠性和穩(wěn)定性，將SeV細(xì)胞培養(yǎng)物接種6周齡Swiss裸鼠，待動(dòng)物出現(xiàn)明顯臨床癥狀后，采集動(dòng)物的口鼻液、血液、糞便及肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織器官，再分別使用建立的RT-PCR和Real-time RT-PCR方法檢測(cè)。結(jié)果顯示，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，除糞便樣品外，SeV攻毒鼠的口鼻液、血液、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織器官均檢出了SeV的特異性基因條帶（圖5）；而經(jīng)Real-time RT-PCR檢測(cè)，除糞便樣品外，其余樣本的熒光信號(hào)曲線(xiàn)均呈顯著擴(kuò)增，其Ct值在22～32個(gè)循環(huán)（圖6）。

圖5 RT-PCR檢測(cè)仙臺(tái)病毒感染鼠不同臨床樣本Fig.5 Detcetion of Sendai virus (Sev) in different clinical samples of mice by RT-PCRM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: 肝臟; 2: 脾臟; 3: 肺臟; 4: 腎臟; 5: 血液; 6: 口鼻液; 7: 糞便M: DNA Marker(DL2000); 1: Liver; 2: Spleen; 3: Lung; 4: Kidney; 5: Blood; 6: Oronasal liquid; 7: Feces

圖6 Real-time RT-PCR檢測(cè)仙臺(tái)病毒感染鼠不同臨床樣本Fig. 6 Detcetion of Sendai virus (SeV) in different clinical samples of mice by Real-time RT-PCR

3 討論

SeV是感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的主要病原之一，危害嚴(yán)重，一旦感染較難從鼠群中清除，影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖和使用中重點(diǎn)防范的疫病。數(shù)十年來(lái)，學(xué)者們對(duì)SeV的病原學(xué)特性和診斷方法進(jìn)行了深入研究。將SeV感染動(dòng)物病料接種BHK-21或Vero細(xì)胞或9日齡SPF雞胚絨毛尿囊腔進(jìn)行病毒分離，是診斷SeV最傳統(tǒng)、最經(jīng)典的方法，但該方法比較耗時(shí)、繁瑣。血凝抑制試驗(yàn)是檢測(cè)SeV傳統(tǒng)方法之一，該方法簡(jiǎn)便易操作，但要選擇敏感性的紅細(xì)胞，且對(duì)試劑的穩(wěn)定性要求較高。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是檢測(cè)SeV經(jīng)典方法之一，但補(bǔ)體滴度直接影響檢測(cè)質(zhì)量且結(jié)果判定的主觀性較強(qiáng)。免疫熒光法也是檢測(cè)SeV的方法之一，其敏感性高，但需要配置熒光顯微鏡。ELISA方法是檢測(cè)SeV常用的血清學(xué)方法，敏感性高、操作簡(jiǎn)便[1,6]。上述血清學(xué)診斷方法，通常僅能檢測(cè)血液樣本，無(wú)法直接檢測(cè)動(dòng)物組織樣本和體液，無(wú)法在SeV感染早期進(jìn)行診斷。鑒于血清學(xué)檢測(cè)方法的局限性，同時(shí)為了滿(mǎn)足口岸對(duì)大量嚙齒類(lèi)動(dòng)物（含實(shí)驗(yàn)動(dòng)物）入境快速檢疫的需要，本研究針對(duì)SeV基因的保守序列，建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR快速核酸檢測(cè)方法。通過(guò)將這兩種檢測(cè)方法應(yīng)用于SeV感染鼠不同臨床樣本和細(xì)胞培養(yǎng)物的檢測(cè)，證實(shí)RTPCR方法能有效擴(kuò)增SeV的特異性基因片段，未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品漏檢和陰性樣品誤檢，Real-time RTPCR檢測(cè)陽(yáng)性和陰性樣品熒光信號(hào)區(qū)分顯著。將兩種檢測(cè)方法的敏感性進(jìn)行對(duì)比，證實(shí)Real-time RTPCR的檢測(cè)下限比普通RT-PCR提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)，由于SeV隱性感染率較高，采用靈敏度高的檢測(cè)方法有助于提高隱性感染的檢出率，做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離，從而盡可能降低損失，并控制SeV的傳播風(fēng)險(xiǎn)。此外，與RT-PCR方法相比，Real-time RTPCR方法檢測(cè)周期更短、操作更簡(jiǎn)便，適合用于SeV疫情的快速高通量篩檢。本研究重新設(shè)計(jì)了SeV特異性的引物和熒光探針，并創(chuàng)新性的將RT-PCR和Real-time RT-PCR兩種核酸檢測(cè)方法互補(bǔ)應(yīng)用于SeV的檢測(cè)，這有助于縮短檢疫周期、提高陽(yáng)性檢出率，降低SeV隨噬齒類(lèi)動(dòng)物進(jìn)入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。

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DEVELOPMENT AND APPLICATION OF RAPID NUCLEIC ACID DETECTION METHODS FOR SENDAI VIRUS

XIONG Wei1, LIN Ying-zheng1, WEI Xiao-feng2, GUO Yu-yan1, ZHANG Qiang1, LIU Jun-ping1, LI Jian1, HU Jian-hua2, HUANG Zhong-rong1
(1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China; 2.Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai 201203, China)

Sendai virus (SeV) is one of common pathogens causing respiratory disease among rodent animals, which is characterized by rapid infection and high recessive infection rates. Therefore, SeV infection is diffi cult to eliminate from affected animals and might interfere with animal experiments. In order to meet requirements for rapid quarantine for rodent animals, RT-PCR and Real-time RTPCR methods were developed using TaqMan probe to detect SeV. Both methods were applied to test clinical samples collected from SeV infected mice and cell cultures. The results showed that RT-PCR and Real-time RT-PCR methods were specifi c, sensitive and reproducible thus both methods were suitable for diagnosis of SeV infection in rodent animals.

Sendai virus; RT-PCR; Real-time RT-PCR; TaqMan probe

S852.659.5

：A

：1674-6422（2014）04-0023-06

2013-12-27

上海市科委科研項(xiàng)目（13DZ0502500）

熊煒，男，博士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物病原檢測(cè)工作

林穎崢，E-mail：linyz@shciq.gov.cn