丁耘峰 平金良 王曉紅 馬志紅

Girdin蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

丁耘峰 平金良 王曉紅 馬志紅

目的 探討Girdin蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及其意義。方法采用免疫組化Envision二步法檢測(cè)128例浸潤(rùn)性乳腺癌、38例導(dǎo)管內(nèi)癌、30例單純性導(dǎo)管上皮增生及30例正常乳腺組織中Girdin蛋白的表達(dá)情況，并分析其臨床病理意義。結(jié)果Girdin蛋白在正常乳腺組織、單純性導(dǎo)管上皮增生、導(dǎo)管內(nèi)癌及浸潤(rùn)性乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為10．0%、23．3%、42．1%、51．6%，呈逐級(jí)上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。浸潤(rùn)性乳腺癌組織中Girdin蛋白的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）表達(dá)明顯相關(guān)，并與患者的生存時(shí)間也明顯相關(guān)（均P＜0．05）。結(jié)論Girdin蛋白在乳腺癌的發(fā)生、演變過(guò)程中起重要作用。其表達(dá)與患者的生存期密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的參考指標(biāo)。

乳腺癌 Girdin蛋白 免疫組化 預(yù)后

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集本院2004-01—2006-12有完整臨床病理資料的手術(shù)切除乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌標(biāo)本128例、導(dǎo)管內(nèi)癌38例及單純性導(dǎo)管上皮增生30例，另取30例正常乳腺組織（取自乳癌切除標(biāo)本中距腫瘤3cm以外并經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常組織）作為對(duì)照。128例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌參照2003年WHO乳腺癌分類及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)均為非特殊類型，組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)26例，Ⅱ級(jí)56例，Ⅲ級(jí)46例；依照國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期32例，Ⅱ期64例，Ⅲ期32例；患者均為女性，年齡35～78歲，中位年齡46歲；每例平均解剖淋巴結(jié)15枚，76例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為59.4%；所有患者術(shù)前均未接受內(nèi)分泌治療或化療。

1.2 試劑 兔抗人Girdin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，CerbB-2單克隆抗體、EnVision二步法試劑盒購(gòu)自丹麥Dako公司，4℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 標(biāo)本用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成4μm厚切片，經(jīng)脫蠟、脫苯、水化，工作濃度Girdin為1∶800，CerbB-2為1∶200，免疫組化染色方法和步驟按EnVision二步法試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，公司提供的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) Girdin蛋白的判定標(biāo)準(zhǔn)：以胞質(zhì)和（或）胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)定和分析，其中無(wú)染色為0分，淺染色為1分，中等染色為2分，強(qiáng)染色為3分；無(wú)染色細(xì)胞為0分，染色細(xì)胞≤25%為1分，染色細(xì)胞占26%～50%為2分，染色細(xì)胞＞50%為3分。將每張切片的染色強(qiáng)度與染色細(xì)胞百分比得分相乘為其總得分，其中0分為陰性（-），1～2分為弱陽(yáng)性（+），3～4分為中度陽(yáng)性（++），≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。通過(guò)CerbB-2免疫組化結(jié)果反映人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）狀況，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照乳腺癌HER-2檢測(cè)指南（2009版），0～+為陰性，+++為陽(yáng)性，++經(jīng)熒光原位雜交檢測(cè)驗(yàn)證。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同組織及臨床特征者之間Girdin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較及關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法，用Log-rank檢驗(yàn)判斷差異性。

2 結(jié)果

2.1 不同乳腺組織Girdin蛋白表達(dá)的比較 Girdin蛋白表達(dá)位于胞質(zhì)和（或）胞核，呈棕黃色顆粒，單純性導(dǎo)管上皮增生和正常乳腺組織中Girdin蛋白陽(yáng)性表達(dá)者均為+，導(dǎo)管內(nèi)癌中陽(yáng)性表達(dá)者以+為主，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌陽(yáng)性表達(dá)者大多呈++～+++（圖1-4）。不同乳腺組織Girdin蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的比較見表1。

圖1 Girdin蛋白在正常乳腺組織中呈陰性表達(dá)（EnVision二步法，×100）

圖2 Girdin蛋白在乳腺導(dǎo)管上皮增生中呈弱陽(yáng)性表達(dá)（EnVision二步法，×200）

圖3 Girdin蛋白在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)（EnVision二步法，×100）

圖4 Girdin蛋白在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（EnVision二步法，×200）

表1 不同乳腺組織Girdin蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的比較

由表1可見，正常乳腺組織、良性導(dǎo)管增生、導(dǎo)管原位癌、浸潤(rùn)性乳腺癌Girdin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈逐級(jí)上調(diào)，浸潤(rùn)性乳腺癌與導(dǎo)管內(nèi)癌、單純性導(dǎo)管上皮增生及正常乳腺組織比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.279、15.226、18.763，P=0.041、0.002、0.000）。

2.2 浸潤(rùn)性乳腺癌不同臨床特征者Girdin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較 見表2。

由表2可見，Girdin蛋白表達(dá)與乳腺癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HER-2表達(dá)相關(guān)（均P＜0.05），而與年齡、腫塊大小及組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。

2.3 Girdin蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性者術(shù)后生存情況的比較 術(shù)后隨訪60～96個(gè)月，繪出Girdin蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的總生存曲線，顯示Girdin蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后有相關(guān)性（P=0.041）（圖5）。

表2 浸潤(rùn)性乳腺癌不同臨床特征者Girdin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

圖5 Girdin蛋白表達(dá)陽(yáng)性和陰性患者的總生存曲線

3 討論

Girdin是一個(gè)由1 870個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的大分子蛋白質(zhì)，又被命名為Akt磷酸化增強(qiáng)子（Akt-phosphorylation enhancer，APE），是一個(gè)新的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，通過(guò)免疫組化可檢測(cè)其表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明Girdin是維持肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)所必需的物質(zhì)[1-2]。肌動(dòng)蛋白骨架的完整性和重組性是維持細(xì)胞形態(tài)和促使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)所必須的，其骨架結(jié)構(gòu)的重組被認(rèn)為在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]，因此可以認(rèn)為Girdin在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲過(guò)程中起重要作用。

本研究結(jié)果顯示，Girdin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率從正常乳腺組織、單純性導(dǎo)管上皮增生到導(dǎo)管內(nèi)癌、浸潤(rùn)性乳腺癌呈逐級(jí)上調(diào)，浸潤(rùn)性乳腺癌的陽(yáng)性表達(dá)率與正常乳腺組織、單純性導(dǎo)管上皮增生及導(dǎo)管內(nèi)癌均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一結(jié)果與Jiang等[5]的報(bào)道相仿，提示Girdin蛋白的高表達(dá)與乳腺癌發(fā)生、演進(jìn)相關(guān)。

Girdin蛋白在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移方面所起的作用可能通過(guò)以下機(jī)制：（1）參與細(xì)胞的移行及腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移一直是惡性腫瘤治療所面臨的最大難題，約90%的惡性腫瘤患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移[6]。體外實(shí)驗(yàn)證明，Girdin蛋白參與調(diào)控細(xì)胞移行。剔除Girdin蛋白的多種細(xì)胞系，包括vero細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MDA-MB-231、HUVEC細(xì)胞等均現(xiàn)出細(xì)胞移行能力受損，腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力下降[2]。Jiang等[5]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌動(dòng)物模型中，剔除 Girdin可使腫瘤的肺轉(zhuǎn)移能力明顯下降。Garcia-Marcos等[7]發(fā)現(xiàn)，在人具有高轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌、結(jié)腸癌及胰腺癌組織中，Girdin蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在Girdin蛋白高表達(dá)的結(jié)腸癌患者中，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的時(shí)間早，患者預(yù)后差。本結(jié)果也證實(shí)Girdin蛋白表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HER-2表達(dá)有明顯關(guān)系，提示Girdin蛋白表達(dá)可影響乳腺癌腫瘤生物學(xué)行為。（2）Girdin蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡以及影響細(xì)胞周期的作用。Ghosh等[8]發(fā)現(xiàn)，Girdin蛋白可以結(jié)合并激活Gi3，后者可進(jìn)一步激活PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。鑒于PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中有重要作用，因此Girdin蛋白必然在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮作用。他們還發(fā)現(xiàn)，在含有GEF片段缺失的 Girdin蛋白異常剪切體的細(xì)胞中，正常的Girdin蛋白表達(dá)受抑制，生長(zhǎng)因子刺激無(wú)法激活Gαi，轉(zhuǎn)而激活有絲分裂相關(guān)的信號(hào)分子，從而影響誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂的發(fā)生和細(xì)胞增殖[9]。Anai等[10]指出，在HepG2細(xì)胞株中剔除Girdin蛋白，則DNA的合成能力明顯下降，并能使細(xì)胞活性及增殖能力明顯下降，細(xì)胞凋亡明顯增加，同時(shí)四倍體及多倍體細(xì)胞增多。（3）Girdin蛋白對(duì)腫瘤新生血管也有促進(jìn)作用。腫瘤血管生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有非常重要的地位，此外在腫瘤的轉(zhuǎn)移中，也扮演著重要角色[11]。Kitamura等[12]報(bào)道，體外實(shí)驗(yàn)顯示Girdin蛋白參與VEGF介導(dǎo)的血管生成作用，剔除Girdin蛋白可導(dǎo)致血管生成受抑制。

本研究通過(guò)測(cè)定乳腺癌組織中Girdin蛋白的表達(dá)以及分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，Girdin蛋白在乳腺癌中的表達(dá)上調(diào)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其過(guò)度表達(dá)顯示更短的無(wú)瘤生存期，進(jìn)一步證實(shí)Girdin蛋白有促進(jìn)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。本文乳腺癌患者的隨訪結(jié)果經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析，Girdin蛋白陽(yáng)性患者生存期低于Girdin蛋白陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故筆者認(rèn)為通過(guò)對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行Girdin蛋白檢測(cè)，其結(jié)果有助于對(duì)患者做出臨床預(yù)后的評(píng)估。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在正常乳腺組織、單純性導(dǎo)管上皮增生、導(dǎo)管內(nèi)癌及浸潤(rùn)性乳腺癌中，Girdin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈逐級(jí)上調(diào)；而且Girdin表蛋白達(dá)與乳腺癌進(jìn)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，并影響患者的預(yù)后。因此Girdin蛋白可作為乳腺癌一個(gè)重要的預(yù)后標(biāo)志物，有望為乳腺癌的診斷和治療提供一條新的途徑，但實(shí)際應(yīng)用仍有待于進(jìn)一步積累資料和研究。

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Expression of Girdin in breast cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of Girdin in breast cancer and its clinicopathological significance．MethodsEnvision immunohistochemical method was used to assess the expression of Girdin in 128 cases of invasive breast cancer,38 cases of breast cancer in situ,30 cases of ductal epithelial simple hyperplasia and 30 normal breast tissue samples．The clinicopathological significance of Girdin expression was evaluated．ResultsThe positive expression of Girdin in normal tissues,simple ductal epithelial hyperplasia,breast cancer in situ and invasive breast cancer was 10．0%,23．3%,42．1%and 51．6% respectively;there were significant differences among groups(P＜0．05)．The expression of Girdin in invasive breast cancer was positively correlated with TNM grading,lymph node metastasis and HER-2 expression;it was negatively correlated with the survival time of patients(all P＜0．05)．ConclusionThe Girdin protein may be involved in the development of breast cancer．The expression of Girdin can be used as a predictor for outcomes of invasive breast cancer．

Breast cancer Girdin Immunohistochemical Prognosis Girdin蛋白是日本學(xué)者于2005年首先發(fā)現(xiàn)的一種新的肌動(dòng)結(jié)合蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)等方面具有重要作用[1-3]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，Girdin蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，尤其在乳腺癌中的地位更顯重要。本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)Girdin蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合各項(xiàng)臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步探討其在乳腺癌臨床診治中的意義。

2013-05-27）

（本文編輯：沈叔洪）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012KYB197）

313000 湖州市中心醫(yī)院外科

丁耘峰，E-mail:dr.dd@163.com