韋友傳孫寶寶陸專靈高 謙羅廷榮

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 南寧 530004; 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所,淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

斜帶石斑魚MyD88基因的原核表達(dá)及蛋白純化

韋友傳1,2孫寶寶1陸專靈1高 謙2羅廷榮1

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 南寧 530004; 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所,淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)是一類重要的模式識(shí)別受體, 其胞外結(jié)構(gòu)域可識(shí)別特定的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), 胞內(nèi)的 TIR (Toll-like/IL-1 receptor)結(jié)構(gòu)域則參與啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧中間體(Reactive oxygen intermediate)、活性氮中間體(Reactive nitrogen intermediate)和促炎癥因子, 在感染早期發(fā)揮重要作用[1]。在哺乳動(dòng)物中, 髓樣分化因子 88(Myeloid differentiation factor 88, MyD88)是TLR信號(hào)通路的關(guān)鍵接頭分子, 其C端TIR域與TLR的TIR相互結(jié)合后, 通過募集IL-1受體相關(guān)激酶(Interleukin-1 receptor-associated kinase, IRAK)IRAK4、IRAK1和IRAK2, 激活NF-κB和MAPK, 進(jìn)而誘導(dǎo)IL-1、TNF和IFN等細(xì)胞因子表達(dá)[2—4]。

迄今為止, 有關(guān)魚類MyD88分子的報(bào)道主要涉及基因克隆和表達(dá)調(diào)節(jié)研究。已有的研究顯示, 人工感染遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的牙鲆(Paralichthys olivaceus), 其頭腎和脾臟中MyD88表達(dá)陽性細(xì)胞顯著增多[5]; 用滅活的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)刺激大黃魚(Pseudosciaena crocea), 其免疫器官 MyD88的表達(dá)水平顯著上調(diào)[6], 滅活的鰻弧菌(Vibrio anguillarum)刺激半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis), 也得到類似結(jié)果[7];應(yīng)用PolyI∶C和鞭毛蛋白刺激虹鱒(Oncorhynchus mykiss)頭腎細(xì)胞, MyD88表達(dá)上調(diào)[8]。Skjaeveland, et al.的研究顯示, 用 CpG ODN 處理轉(zhuǎn)染大西洋鮭(Salmo salar) MyD88基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞, 可激活 NF-κB表達(dá)[9]。此前, 我們已克隆到斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)的TLR1、TLR2及MyD88基因, 分析了它們的表達(dá)模式及其表達(dá)調(diào)節(jié)[10,11]。本研究旨在原核表達(dá)并純化斜帶石斑魚MyD88重組蛋白, 為研究和解析斜帶石斑魚MyD88生物學(xué)功能與魚類TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 斜帶石斑魚MyD88基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)斜帶石斑魚MyD88 cDNA序列(GenBank登錄號(hào): HQ197956), 設(shè)計(jì)特異性引物 MyD88-F1: 5'-CTGTCGTC TCCGGAAACTCTCCAAC-3'和 MyD88-R1: 5'-TGGTCC TTGGTTACGGCAGCGAGA-3', 以斜帶石斑魚脾臟cDNA為模板, 擴(kuò)增包含MyD88開放閱讀框的序列片段。25 μL體系PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 3 0s 、63 ℃ 3 0s、72 ℃60s, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃ 1 0min 。瓊脂糖凝膠電泳, 回收純化目的片段, 連接 pMD18-T載體, 轉(zhuǎn)化 TOP10感受態(tài)細(xì)胞, PCR鑒定陽性克隆, 提取重組質(zhì)粒pMD18T-MyD88-1。

設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物 MyD88-F2: 5'-TCGGATCCATGGCGTGTAAGGACCCAGA-3'和MyD88-R2: 5'-TGCTCGAGTCGGCAGCGAGAGCGCCTTG-3', 下劃線所示分別為限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho1 I的酶切位點(diǎn)。以pMD18T-MyD88-1為模板, PCR反應(yīng)條件、目的片段回收、連接、轉(zhuǎn)化和陽性克隆篩選同上。提取重組質(zhì)粒pMD18T-MyD88-2, 使用 BamH I和 Xhol I分別對(duì)pMD18T-MyD88-2和 pET-32a雙酶切, 回收酶切片段, 16℃連接過夜, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10細(xì)胞。PCR篩選重組克隆, 提取重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a-MyD88, 測(cè)序檢查有無移碼或突變。

1.2 斜帶石斑魚MyD88重組蛋白表達(dá)、純化及免疫印跡檢測(cè)

將pET-32a-MyD88和作為對(duì)照的pET-32a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3), 將陽性克隆接種到10 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)液中, 37 ℃ 210 r/min 振蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到0.6—0.8, 各取1 mL作為對(duì)照。加入IPTG至終濃度1 mmol/L, 37 ℃ 210 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4h, 4℃離心(5000 g, 5min), 用1/10體積PBS重懸菌體沉淀, 超聲破碎, 4℃離心(12000 g, 15min)后分別收集上清和沉淀。

SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)后, 將單克隆陽性菌落進(jìn)行50 mL擴(kuò)大培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá), 4℃離心(5000 g, 5min), 5 mL 1×結(jié)合緩沖液(0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L咪唑, pH 7.9)重懸菌體, 冰浴條件下超聲破碎(30min), 4℃離心(12000 g, 15min), 去上清。加入3 mL含6 mol/L尿素的1×結(jié)合緩沖液, 重懸沉淀, 冰浴1 h徹底溶解包涵體。4℃離心(12000 g, 30min), 收集上清, 加入到離子化并平衡后的 His-Bind親和層析柱 (Novagen),以5 mL/h流速過柱; 隨后依次用5 mL含6 mol/L尿素的1×結(jié)合緩沖液和3 mL含6 mol/L尿素的1×清洗緩沖液(0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, 60 mmol/L咪唑, pH 7.9)過柱, 去除非特異性結(jié)合蛋白; 用2.5 mL含6 mol/L尿素的洗脫緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCl, 200 mmol/L咪唑, pH 7.9)進(jìn)行洗脫。

SDS-PAGE蛋白電泳后, 使用Mini Trans-Blot電轉(zhuǎn)儀,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜(80 V, 1h)。TBS溶液(0.1 mol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris, pH 7.5)漂洗3次, 5%脫脂奶粉封閉(2h), 與1∶3000稀釋的抗6-His單抗室溫孵育1h; TBS漂洗3次后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的1∶500稀釋的二抗, 室溫孵育1h; 反應(yīng)結(jié)束后使用NBT/BCIP避光顯色。

2 結(jié)果

2.1 斜帶石斑魚MyD88原核表達(dá)載體pET-32a-MyD88

通過克隆(pMD18T-MyD88-1)和亞克隆(pMD18TMyD88-2)制備, 使用 BamH I和 Xho1 I對(duì) pMD18TMyD88-2和 pET-32a分別雙酶切, 膠回收 MyD88和pET-32a片段, 連接、轉(zhuǎn)化, 提取獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-MyD88。PCR鑒定結(jié)果以及BamH I與Xhol I雙酶切得到的900 bp和5800 bp的兩個(gè)片段, 均與預(yù)期一致。測(cè)序結(jié)果表明插入的斜帶石斑魚MyD88基因表達(dá)框無移碼或突變。

2.2 斜帶石斑魚MyD88的重組表達(dá)與純化的融合蛋白

將pET32a-MyD88轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3), 與誘導(dǎo)前相比, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后, SDS-PAGE電泳圖譜中明顯新增約53 kD的蛋白條帶, 與推測(cè)的融合蛋白分子量相當(dāng), 而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pET32a的陰性對(duì)照在誘導(dǎo)前后均未見相應(yīng)的蛋白條帶(圖1)?？扇苄苑治鲲@示融合蛋白以包涵體形式表達(dá)。用6 mol/L尿素溶解包涵體, 經(jīng)His-Bind親和層析柱純化, 電泳結(jié)果顯示洗脫液中蛋白純度較高,純化蛋白的分子量與預(yù)計(jì)相符(圖1)。

圖1 MyD88重組蛋白表達(dá)的特異性與可溶性分析Fig. 1 Expression specificity and dissolubility of the recombinant MyD88 protein

2.3 免疫印跡

利用抗 6-His單克隆抗體及相應(yīng)二抗, 對(duì)含pET32a和 pET32a-MyD88的大腸桿菌 BL21重組菌誘導(dǎo)前后表達(dá)的蛋白和純化的蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè),結(jié)果顯示 pET32a-MyD88重組菌誘導(dǎo)后及純化洗脫液中均可檢測(cè)到的分子量約53 kD的蛋白條帶(圖2), 進(jìn)一步證實(shí)純化蛋白為含 6-His標(biāo)簽的斜帶石斑魚MyD88融合蛋白。空載體pET32a經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)分子量約為21 kD的標(biāo)簽蛋白。

圖2 MyD88重組蛋白的免疫印跡檢測(cè)Fig. 2 Western blot detection of the recombinant MyD88 protein

3 討論

pET表達(dá)系統(tǒng)是功效最強(qiáng)大的重組蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)之一, 其特點(diǎn)在于由T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄翻譯信號(hào)調(diào)控表達(dá)框中插入的外源基因表達(dá)。宿主菌BL21 (DE3)中的T7 RNA聚合酶在IPTG作用下高效表達(dá), 進(jìn)而可充分調(diào)動(dòng)宿主菌資源表達(dá)目的基因[12,13]。pET-32a融合表達(dá)載體秉承了pET可高效表達(dá)目的蛋白的特性, 且在目的片段前插入硫氧還蛋白(Trx)基因, 109個(gè)氨基酸殘基的硫氧還蛋白與目的蛋白融合在一起, 幫助目的蛋白折疊, 增加其可溶性; 在融合蛋白N端還帶有6-His標(biāo)簽便于目的蛋白的親和純化與鑒定[14,15]。

MyD88屬于Toll/IL-1R家族成員, 是TLR信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要接頭分子, 參與除TLR3外所有TLR家族成員的信號(hào)傳導(dǎo)。本研究通過 RT-PCR擴(kuò)增斜帶石斑魚MyD88基因ORF序列, 克隆(pMD-18T-MyD88-1)與亞克隆(pMD-18T-MyD88-2)制備, 以及BamH I與Xhol I雙酶切, 成功構(gòu)建了斜帶石斑魚 MyD88原核表達(dá)載體pET32a-MyD88。將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化和免疫印跡檢測(cè), 證實(shí)本研究構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-MyD88在大腸桿菌中成功地進(jìn)行了斜帶石斑魚MyD88融合蛋白的高效表達(dá)。所制備的帶有 6-His標(biāo)記的高純度的斜帶石斑魚 MyD88重組蛋白為后續(xù)研究魚類MyD88在TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和先天性免疫中的作用奠定了一定基礎(chǔ)。

[1] Werling D, Jungi T W. Toll-like receptors linking innate and adaptive immune response [J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2003, 91(1): 1—12

[2] Sha Z, Abernathy J W, Wang S, et al. NOD-like subfamily of the nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing family receptors and their expression in channel catfish [J]. Developmental and Comparative Immunology, 2009, 33(9): 991—999

[3] Takeda K, Akira S. Toll-like receptors in innate immunity [J]. International Immunology, 2005, 17(1): 1—14

[4] Kawai T, Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors [J]. Nature Immunology, 2010, 11(5): 373—384

[5] Takano T, Kondo H, Hirono I, et al. Identification and characterization of a myeloid differentiation factor 88 (MyD88) cDNA and gene in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus [J]. Developmental and Comparative Immunology, 2006, 30(9): 807—816

[6] Yao C L, Kong P, Wang Z Y, et al. Molecular cloning and expression of MyD88 in large yellow croaker, Pseudosciaena crocea [J]. Fish and Shellfish Immunology, 2009, 26(2): 249—255

[7] Yu Y, Zhong Q W, Zhang Q Q, et al. Full-length sequence and expression analysis of a myeloid differentiation factor 88 (MyD88) in half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis [J]. International Journal of Immunogenetics, 2009, 36(3): 173—182

[8] Purcell M K, Smith K D, Hood L, et al. Conservation of toll-Like receptor signaling pathways in teleost fish [J]. Comparative Biochemistry and Physiology-Part D: Genomics and Proteomics, 2006, 1(1): 77—88

[9] Skjaeveland I, Iliev D B, Strandskog G, et al. Identification and characterization of TLR8 and MyD88 homologs in Atlantic salmon (Salmo salar) [J]. Developmental and Comparative Immunology, 2009, 33(9): 1011—1017

[10] Wei Y C, Pan T S, Chang M X, et al. Cloning and expression of Toll-like receptors 1 and 2 from a teleost fish, the orangespotted grouper Epinephelus coioides [J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2011, 141(3-4): 173—182

[11] Wei Y C, Gao Q, Chang M X, et al. Cloning and expression of MyD88 gene in orange-spotted grouper Epinephelus coioides [J]. Genomics and Applied Biology, 2011, 30(3): 288—295 [韋友傳, 高謙, 昌鳴先, 等. 斜帶石斑魚MyD88基因的克隆與表達(dá). 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2011, 30(3): 288—295]

[12] Yuan L D, Hua Z C. Expression, purification, and characterization of a biologically active bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli [J]. Protein Expression and Purification, 2002, 25(2): 300—304

[13] Umeyama T, Naruoka A, Horinouchi S. Genetic and biochemical characterization of a protein phosphatase with dual substrate specificity in Streptomyces coelicolor A3(2) [J]. Gene, 2000, 258(1-2): 55—62

[14] Ribas A V, Ho P L, Tanizaki M M, et al. High-level expression of tetanus toxin fragment C-thioredoxin fusion protein in Escherichia coli [J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 2000, 31( Pt 2): 91—94

[15] Zhao J H, Xu Z, Hua Z C. Expression of human cardiac-specific homeobox protein in Escherichia coli [J]. Protein Expression and Purification, 2000, 18(3): 316—319

PROKARYOTIC EXPRESSION AND PROTEIN PURIFICATION OF THE MYD88 GENE IN GROUPER EPINEPHELUS COIOIDES

WEI You-Chuan1,2, SUN Bao-Bao1, LU Zhuan-Ling1, GAO Qian2and LUO Ting-Rong1
(1. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

斜帶石斑魚; MyD88; 原核表達(dá); 蛋白純化

Epinephelus coioides; MyD88; Prokaryotic expression; Protein purification

Q786

A

1000-3207(2014)01-0200-03

10.7541/2014.29

2012-09-28;

2013-07-19

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973)項(xiàng)目(2009CB118703); 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30871937)和廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012GXNSFAA053045)資助

韋友傳(1971—), 男, 廣西羅城人; 博士; 研究方向: 水產(chǎn)動(dòng)物分子免疫學(xué)與病原學(xué)。E-mail: weiyc@gxu.edu.cn

高謙, E-mail: gaoqian@ihb.ac.cn