孫玉濤應(yīng)琳琳張亞莉徐立紅

(1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系, 杭州 310058; 2. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 南通 226000)

三丁基錫和微囊藻毒素對小鼠肝臟p-Ezrin的影響

孫玉濤1應(yīng)琳琳1張亞莉2徐立紅1

(1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系, 杭州 310058; 2. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 南通 226000)

埃茲蛋白(Ezrin)是連接細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架之間的膜細(xì)胞骨架連接蛋白, 通過其C端、N端分別與細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜蛋白結(jié)合, 屬于 ERM (Ezrin-radixin-moesin)家族成員。由于Ezrin在細(xì)胞中的特殊位置, 不僅在細(xì)胞的運(yùn)動、黏附等正常生理活動中起重要作用, 而且能調(diào)控黏附分子, 參與癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

Ezrin在細(xì)胞中有活化和失活兩種狀態(tài), 目前認(rèn)為主要是通過磷酸化和脫磷酸化調(diào)節(jié)。磷酸化作用能夠激活Ezrin, 打開其空間構(gòu)象, 暴露結(jié)合位點(diǎn), 進(jìn)而發(fā)揮其功能。而對Ezrin脫磷酸化可使其恢復(fù)原來狀態(tài), 使結(jié)合位點(diǎn)再次遮蔽。Ezrin在腫瘤發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用, 如埃茲蛋白在小兒骨肉瘤和橫紋肌肉瘤的轉(zhuǎn)移中起重要作用[1,2], 因此 Ezrin有望成為惡性腫瘤預(yù)后判斷的生物標(biāo)記物[3—5]。

Ezrin的脫磷酸化由蛋白磷酸酶 2A(Protein phosphatase 2A, PP2A)催化, 可使其處于失活狀態(tài)[6], 引起Ezrin定位及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的改變, 最終導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動性的改變。水污染物微囊藻毒素LR(Microcystin-LR, MCLR)是一種極強(qiáng)的PP2A抑制劑, 研究發(fā)現(xiàn)它對PP2A的抑制可以引起細(xì)胞中與 PP2A相關(guān)的信號通路及細(xì)胞骨架的改變[7—11], 同時還發(fā)現(xiàn)水污染物三丁基錫(Bributyltin, TBT)也對小鼠組織與FL細(xì)胞中的PP2A有明顯的抑制作用并同時引起PP2A相關(guān)信號通路的改變[12—14]。

其中MCLR和TBT是目前存在較為廣泛的水污染物,進(jìn)入水體后, 易在食用水生生物體內(nèi)蓄積, 對水生生物具有一定的毒性, 一旦被人食用, 會對人類健康構(gòu)成潛在威脅[15],可以誘發(fā)肝毒性并且與人群中的肝癌發(fā)生密切相關(guān)[16]。

作為PP2A作用的底物, 當(dāng)外源性物質(zhì)影響PP2A后p-Ezrin水平極有可能改變并影響其功能, 因而p-Ezrin有望成為一種生物標(biāo)志物用于預(yù)測外源性物質(zhì)對生物的可能危害。鑒于MCLR和TBT的廣泛毒性尤其是對哺乳動物的免疫和肝毒性效應(yīng)[17—19], 本研究初步研究MCLR和TBT對小鼠肝臟Ezrin及p-Ezrin表達(dá)的影響, 對于探討建立一項(xiàng)新生物標(biāo)志物有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

TBT-Cl 購自美國 Acros公司, 為無色液體, 純度90%; MCLR購自Sigma 公司; α-tubulin一抗(鼠來源單抗)購自Abcam公司; Ezrin和p-Ezrin(兔來源單抗)購自Cell Signaling公司; 山羊抗兔、山羊抗鼠二抗(紅外熒光標(biāo)記)購自美國LI-COR公司; 硝酸纖維素膜購自BIO-RAD公司; 濾紙購自Whatman 公司; 苯甲基磺酰氟(PMSF)購自加拿大 Sangon Ltd公司, 二硫蘇糖醇(DTT)購自美國Amresco公司; 其余試劑均為市售分析純。儀器主要包括Synergy HT酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司, 美國); 超低溫冰箱(Thermo公司, 美國)等。

1.2 動物分組和處理

從浙江省醫(yī)科院動物實(shí)驗(yàn)中心購進(jìn)健康雄性 ICR小鼠, 體質(zhì)量(22 ± 1) g, 在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng), 飼養(yǎng)條件為(24 ± 1) , ℃ 自由飲食, 晝夜光暗周期12h/12h, 實(shí)驗(yàn)前觀察飼養(yǎng) 3d。TBT染毒的小鼠, 劑量分別為10、20、60 mg/kg, 對照組用溶劑玉米油灌胃, 每組3只, 灌胃24h后, 頸椎脫臼處死小鼠。迅速取其肝臟組織, 并用預(yù)冷的生理鹽水清洗, 分裝后迅速放入液氮速凍, 置于–70℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

MCLR先溶于少量 DMSO, 再用水稀釋至所需的濃度, 腹腔注射染毒, 注射體積為 10 μL/g(DMSO濃度＜0.19 mg/mL)。每組 20只小鼠, 劑量分別為 0 μg/kg, 40 μg/kg, 60 μg/kg, 80 μg/kg, 腹腔注射后分別在6h、12h、24h取樣。頸椎脫臼處死小鼠后小心分離肝臟組織, 用冷生理鹽水清洗, 置于–70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 組織蛋白的提取

冰上稱取約0.1 g組織塊, 加入1.5 mL組織裂解液(Tris-Cl 0.6057 g, NaCl 0.8766 g, EDTA 0.3722 g, TritonX-100 0.5 mL), 置于冰上充分勻漿后, 12000 g, 10min, 4℃離心, 收集上清。Bradford法測蛋白濃度, 樣品按每管60 μg分裝后于–70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Western blot 技術(shù)檢測Ezrin及p-Ezrin表達(dá)水平

Western blot步驟參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版》[20]略加修改(封閉液用 5%牛血清白蛋白, 二抗用紅外熒光標(biāo)記二抗), 一抗和二抗稀釋比參照抗體說明書。孵好二抗的硝酸纖維素膜, TBST清洗未結(jié)合的二抗后, 于Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描熒光強(qiáng)度。

Quantity one 圖像分析軟件分析各條帶灰度值, 結(jié)果以各目的條帶和內(nèi)參的灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件, 單因素方差分析(ANOVA), 以P ＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MC-LR 對Ezrin 表達(dá)的影響

分別用40、60、80 μg/kg MC-LR處理小鼠, 檢測處理24h后, 各處理組Ezrin和p-Ezrin的變化。隨著染毒濃度的增加, Ezrin的表達(dá)量并沒有明顯變化, 而p-Ezrin的水平有明顯上升趨勢, 并呈現(xiàn)濃度依賴性。(圖1)

2.2 TBT 對Ezrin 表達(dá)的影響

小鼠經(jīng)0、10、20和60 mg/kg TBT染毒24h后, 肝臟 Ezrin的表達(dá)與對照組相比并未發(fā)生明顯改變, 而p-Ezrin的水平與對照組相比在10、20和60 mg/kg濃度處有明顯增加, 并呈現(xiàn)濃度依賴性(圖2)。

圖1 MCLR不同處理組小鼠肝臟中Ezrin和p-Ezrin蛋白水平(n=3, *P＜0.05)Fig. 1 Ezrin and p-Ezrin protein level in mouse liver exposed to MCLR (n=3, *P＜0.05)

圖2 TBT不同處理組小鼠肝臟中Ezrin和p-Ezrin蛋白水平(n=3, *P＜0.05)Fig. 2 Ezrin and p-Ezrin protein level in mouse liver exposed to TBT (n=3, *P＜0.05)

3 討論

Ezrin在細(xì)胞中的活化和失活兩種狀態(tài)與 Ras、Rho信號途徑, AKT、MAPK等信號通路密切相關(guān)。而MCLR作為一種PP2A的抑制劑, 進(jìn)入細(xì)胞后, 不僅能強(qiáng)烈抑制絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶 PP2A的活性[21], 同時能夠通過其對PP2A的抑制作用調(diào)控MAPK、Akt等信號通路。同時, TBT也能抑制PP2A活性并干擾MAPK、Akt等信號通路。

在本實(shí)驗(yàn)中MCLR與TBT都引起了p-Ezrin的升高,活性增強(qiáng), 而Ezrin活性的變化可能影響組織細(xì)胞內(nèi)正常的生理功能。這一過程可能是通過抑制 PP2A, 也有可能是通過干擾MAPK、Akt等信號通路或者伴有其他通路的激活, 形成細(xì)胞內(nèi)信號調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)式反應(yīng)。而目前對Ezrin相關(guān)信號通路的作用機(jī)制尚未完全闡明, 或有新的功能、機(jī)制尚未發(fā)現(xiàn), 更重要的是其上游表達(dá)調(diào)控尚未闡明。因此, 本實(shí)驗(yàn)后續(xù)的工作將增加對 PP2A酶活和MAPK、Akt等信號通路相關(guān)蛋白的檢測, 研究MCLR和TBT染毒后, PP2A以及MAPK, Akt等信號通路是否參與到Ezrin活性的調(diào)控中, 以期更深入地研究Ezrin 對細(xì)胞信號通路及胞內(nèi)正常生理功能的影響。這不僅對 MCLR和 TBT肝毒性機(jī)制的研究提供了一個新的方向, 也為發(fā)展p-Ezrin為一項(xiàng)新生物標(biāo)志物提供了重要依據(jù)。

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EFFECT OF TBT AND MICROCYSTIN-LR ON P-EZRIN LEVEL IN MOUSE LIVER

SUN Yu-Tao1, YING Lin-Lin1, Zhang Ya-Li2and XU Li-Hong1
(1. Department of Biochemistry, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. School of Medicine of Nantong University, Nantong 226000, China)

微囊藻毒素LR; 三丁基錫; 磷酸化埃茲蛋白; 生物標(biāo)志物

MCLR; TBT; p-Ezrin; Biomarker

X171.5

A

1000-3207(2014)01-0197-03

10.7541/2014.28

2012-07-28;

2013-04-12

國家自然科學(xué)基金81172703資助

孫玉濤(1988—), 男, 山東莒縣人; 碩士; 主要從事環(huán)境毒理研究。E-mail: syt2006dxx@126.com

徐立紅, E-mail: xulihong@zju.edu.cn