李衛(wèi)芬 鄭佳佳 張小平 鄧 斌

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058)

反硝化酶及其環(huán)境影響因子的研究進展

李衛(wèi)芬 鄭佳佳 張小平 鄧 斌

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058)

隨著全球經(jīng)濟的迅速發(fā)展, 環(huán)境問題特別是水環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)長期大量使用化肥, 養(yǎng)殖水體積累了大量的魚類糞便和餌料殘渣, 導(dǎo)致水體氮素含量嚴(yán)重超標(biāo), 形成水體氮污染, 其中亞硝酸鹽能氧化魚蝦體內(nèi)的亞鐵血紅蛋白, 使其成為高鐵血紅蛋白, 喪失運輸氧氣的能力, 導(dǎo)致水生生物大批患病甚至死亡, 嚴(yán)重影響水質(zhì)和水產(chǎn)品安全[1]。近年來國內(nèi)外對氮污染的治理日益重視, 目前微生態(tài)技術(shù)是當(dāng)前水環(huán)境污染治理的研究熱點[2]。微生物的反硝化作用是地球氮素循環(huán)的重要分支, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖污染水體脫氮修復(fù)中起重要作用。其關(guān)鍵酶與細(xì)菌反硝化性能的強弱密切相關(guān), 許多學(xué)者對反硝化細(xì)菌的各種反硝化酶進行研究[3]。本文從反硝化酶系和環(huán)境因子兩方面, 對反硝化作用的影響進行了系統(tǒng)論述, 旨在為反硝化細(xì)菌在水體氮污染控制的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 反硝化關(guān)鍵酶

1.1 硝酸還原酶

細(xì)菌好氧反硝化的第一步是硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,由硝酸還原酶催化。反硝化菌通常包含一種或兩種硝酸還原酶, 一種是膜結(jié)合硝酸還原酶(NAR), 另一種為周質(zhì)硝酸還原酶(NAP)。NAR在厭氧條件下優(yōu)先表達, 且僅在厭氧狀態(tài)下發(fā)揮作用; NAP在有氧條件下優(yōu)先表達, 也存在于厭氧生長的細(xì)胞中, 當(dāng) NAR被氧抑制時, 它仍具有硝酸還原能力[4]。

NAR NAR是一個由 3個亞基組成的復(fù)合物NarGHI, 屬于鉬喋呤氧化還原酶家族[5]。亞基 N arI將酶固定到膜上, 接受來自醌的電子, 通過兩個亞鐵血紅素 b將電子傳遞到 NarH; NarH通過鐵硫鍵將電子傳遞到NarG胞質(zhì)一側(cè)的活性位點—鉬協(xié)作因子或核苷鉬輔因子;同時硝酸鹽在還原過程中形成 N和 H2O, 釋放到周質(zhì),電子傳遞到NarI[6]=。氧氣以限制硝酸根通過細(xì)胞質(zhì)膜來間接抑制此酶的活性, 使之在有氧條件下失活。NAR存在于Escherichia coli、Pseudomons denitrificans、Bacillus licheniformis、Bacillus stearothermophilus、Paracoccus denitrification等微生物中[7]。

NAP NAP是由2 個亞單位(NapA和NapB)組成的二聚體。大亞基NapA由基因napA編碼, 為還原硝酸鹽的作用位點, 包含輔因子鉬蝶呤鳥苷二核苷酸(MGD)和一個鐵硫中心。NapB由基因napB編碼, 為二血紅素細(xì)胞色素C552[8]。鐵硫中心協(xié)助血紅素c和MGD之間的電子傳遞。NapC編碼一種四血紅素c型細(xì)胞色素, 有兩個結(jié)構(gòu)域, 每個結(jié)構(gòu)域包含一個雙血紅素, 每個血紅素末梢都有一個組氨酸殘基。NapC在周質(zhì)中表達, 負(fù)責(zé)將電子從泛醌傳遞到NapAB[7]。與NAR相比, NAP對硝酸根有更高的底物專一性, 對疊氮化物的抑制不敏感; 硫氰酸鹽可以競爭性地與NAP結(jié)合, 是 N AP的一種抑制劑[7]。目前, 一些細(xì)菌, 如Haemophilus influenzae、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonas sp.和Sulfurimonas denitrifcans等編碼NAP的基因先后被鑒定[9]。

1.2 亞硝酸還原酶

在反硝化過程中, 由亞硝酸還原酶(NIR)催化亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變成一氧化氮, 實現(xiàn)了水體中的氮向大氣中氮的轉(zhuǎn)變, 在反硝化過程中扮演了重要角色。NIR分布于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間, 根據(jù)其輔基的不同一般分為由 nirS編碼的血紅素cd1型亞硝酸還原酶(cd1-NiRs)和由nirK編碼的銅型亞硝酸還原酶(Cu-NiRs), 它們分別以血紅素 cd1和Cu作為輔基[5]。通常由于反硝化NIR類型有排外性, NirK和 NirS雖然等價, 生態(tài)位分化導(dǎo)致每個菌體只存在其中的一種[10]。

Cu-NiR Cu-NiR是可溶性三角形酶, 每個單體有兩個銅中心, Ⅰ型和Ⅱ型[11]。Ⅰ型Cu為電子進入位點, 主要的電子供體為天青蛋白和假天青蛋白[12], Ⅱ型Cu為底物結(jié)合位點, 受His100, His135和 His306調(diào)控。電子從Ⅰ型Cu中心, 通過Asp和His的化學(xué)途徑傳遞到Ⅱ型Cu中心, 還原 N為 N O。有研究證實 T hiosphoera pantotropha、Bdellovibrio bacteriovorus、Chromobacterium violaceum、Pseudoalteromonas haloplanktis和 Bacillus azotoformans中都存在Cu-NiR[12]。此外, 一些Neisseria菌中存在另一種位于外部膜的亞硝酸鹽還原酶 AniA, 為Cu-NiR的同源體[13]。

cd1-NiR cd1-NiR是一種雙功能酶, 催化 N得到一個電子轉(zhuǎn)變成 N O, 使O2得到 4 個電子生成水[14]。細(xì)胞色素cd1-NiR為同二聚體周質(zhì)蛋白質(zhì), 每個單體上含有兩個亞鐵血紅素基團, c型和d1型[7]。其電子供體為天青蛋白、細(xì)胞色素c551或假天青蛋白, 電子通過c型血紅素傳遞到d1型血紅素, NO2–結(jié)合在d1血紅素上還原為NO[14](圖 3)。研究表明, 許多菌中都可分離到細(xì)胞色素cd1-NiR, 包括Stenotrophomonas maltophilia、Pseudomonas aeruginosa、Thiosphaera pantotropha、proteobacteria, Pseudomonas denitrificans和Paracoccus pantotrophus[7]。

1.3 一氧化氮還原酶

一氧化氮還原酶(NOR)催化一氧化氮還原為一氧化二氮形成 N -N鍵, 該酶屬于亞鐵血紅素-銅氧化酶, 根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu), 可分為三種: cNor、qNor和qCuNor[12]。

cNor cNor為膜結(jié)合細(xì)胞色素bc型酶, 也稱短鏈Nor(scNor), 由cnorB基因編碼, 包含一個小亞基NorC和一個大亞基NorB。NorC固定于質(zhì)膜, 包含一個亞鐵血紅素 c, 配合一個保守組氨酸和一個蛋氨酸, 將電子傳遞到催化單元NorB[15]。NorB為一膜錨定蛋白, 包含兩個亞鐵血紅素 b和一個非亞鐵血紅素鐵。其中一個亞鐵血紅素b, 配合兩個保守組氨酸, 將電子轉(zhuǎn)移到二金屬雙核催化反應(yīng)中心, 釋放 N2O到周質(zhì)[12]。在亞鐵細(xì)胞色素 c 作為電子供體的條件下, 此酶顯示出很高的一氧化氮還原酶活性[7]。研究發(fā)現(xiàn) cnorB基因類型的菌有 Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas srutzeri、Paracoccus denitrfican、Halomonas halodenitrficans、Rhodobacter sphaerroides、Bradyrhizobium japonicum和Alcaligenes faecalis[16]。

qNor 在Ralstonia eutropha中發(fā)現(xiàn)另一種一氧化氮還原酶qNor, 也稱NorZ或長鏈Nor(lcNor)。該酶是單體酶, 由qnorB基因編碼。qNor多肽鏈與cNor有很高的同源性, 由一個N端延伸和一個C端域組成[17]。其N端為對苯二酚結(jié)合位點[17], C端類似于cNor酶的催化亞基NorB[16]。該酶在反硝化和非反硝化細(xì)菌中都有, 而后者經(jīng)常有致病性[12]。Hendriks, et al.[18]研究表明含有 q Nor酶的菌主要有Staphylococcus aureus、Bacillus stearothermophilus、Mycobacterium avium、Corynebacterium diphtheriae、Synechocystis sp.和Ralstonia eutropha。

qCuANor 革蘭氏陽性菌中存在第三種類型的一氧化氮還原酶qCuANor。該酶含有兩個亞基, 最大的催化亞基類似NorB, 含有兩個亞鐵血紅素b, 小亞基利用CuA位點獲得電子傳遞到催化亞基[6]。該酶利用延胡索酸和細(xì)胞色素c551為電子供體, 前者作用于一氧化氮脫毒作用,后者作用于反硝化[19]。qCuANor僅在 Bacillus azotoformans中, 而其編碼基因尚未發(fā)現(xiàn)[5]。

1.4 一氧化二氮還原酶

一氧化二氮還原生成氮氣, 為完全反硝化的最終步驟, 催化該反應(yīng)的一氧化二氮還原酶(N2OR), 為多銅二聚體酶, 由 nosZ 基因編碼其催化中心。在革蘭氏陰性菌中為周質(zhì)酶, 革蘭氏陽性菌中為膜結(jié)合酶[6]。

好氧與厭氧反硝化菌中分離出的 N2OR在分子性質(zhì)上非常相似[7]。根據(jù)氧化還原特性和光譜學(xué)分析, 可分為Ⅰ型(purple型)和Ⅱ型(pink型), 其中Ⅱ型是從有氧狀態(tài)下的培養(yǎng)物中分離而來[5]。該同型二聚體酶每個亞基都包含6個Cu原子, 它們排列成2個不同類型的多聚銅活性中心, 一個是雙核電子傳遞位點CuA; 另一個是四核催化位點 CuZ。CuA從細(xì)胞色素 c、延胡索酸或假天青素[6,7]得到電子, 傳遞到亞基CuZ, 在此N2O還原成N2。

N2OR從Pseudomonas stutzeri首次分離得到, 其后陸續(xù)在其他菌中發(fā)現(xiàn): Pseudomonas stutzeri、Rhodobacter capsulatus、Wolinella succinogenes、Achromobacter cycloclastes、Pseudomonas aeruginosa、Paracoccus pantotrophus、Alcaligenes xylosoxidans、Pseudomonas nautica等。通常攜帶 nirS的菌也帶有 nosZ, 極少例外, 而攜帶 nirK的菌更多使用不完全反硝化途徑, 推測與其進化機制有關(guān)[20]。

2 影響反硝化的因素

對微生物生長發(fā)育具有直接或間接影響的環(huán)境要素,被稱為環(huán)境因子。環(huán)境因子如電子受體、碳源、碳氮比、溶解氧、pH和溫度等, 為反硝化的重要影響因素。

2.1 電子受體

作為電子受體, 硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮是控制反硝化效率的最直接因素。在Verbaenderta, et al.[21]的研究中, 70.5%反硝化菌以硝酸鹽為電子受體, 45.5%以亞硝酸鹽為電子受體, 18.2%該兩種電子受體都能利用, 95.5%能以兩者的復(fù)合物為電子受體。Paracoccus pantotrophus以氧和硝酸鹽共同作為電子受體時其生長速率高于以單一底物作為電子受體時的速率, 最后獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)率也最高,缺少或O2都會降低細(xì)菌的生長率和反硝化率[22]。有研究表明,濃度越高, Pseudomonas mandelii反硝化基因表達更持久[23]。

2.2 碳源

反硝化菌以有機碳為主要電子供體, 碳源含量為影響好氧反硝化的主要因素[4]。Bernat, et al.[24]利用活性污泥處理無碳源的合成廢水時脫氮率為1.54 mg[N]/L, 而處理投加醋酸鈉的配制廢水時脫氮率達到 22.50 mg[N]/L,說明好氧反硝化菌外源呼吸比內(nèi)源呼吸效率高。在對群落和碳源關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn), 醋酸對污水處理廠發(fā)現(xiàn)的反硝化菌Thauera和Acidovorax具有選擇作用; 乙醇或甲醇可以誘導(dǎo)出獨特的反硝化群落, 而且對cd1-NiR反硝化菌影響更大。在乙酸鈉和丁二酸鈉為碳源時, 反硝化菌對亞硝酸鹽氮的去除率最高, 而對乳酸、蔗糖的碳源利用率較低,亞硝酸鹽氮去除率相對較小, 可見菌對小分子碳源的利用率較高, 而對大分子碳源的利用率較低[25]。

2.3 碳氮比

C/N 在反硝化過程中同樣也起著很重要的作用, 脫氮率隨C/N的提高而增加。Citrohucter diversus以醋酸為碳源且C/N為4—5時可得到最佳的反硝化活性, 該C/N較缺氧反硝化時所需要的 C/N高; 生物反應(yīng)器中反硝化菌群以蔗糖為碳源C/N為2.5亞硝酸鹽氮去除率最大達到5 mg/L[26]。有研究發(fā)現(xiàn), 還原性的碳源越多, 周質(zhì)硝酸鹽還原酶的活性越高[27]; 低C/N、NOR和N2OR等競爭力較弱的還原酶(其中N2OR最弱)活性就會受抑制[4]。隨C/N降低, 反硝化相關(guān)基因表達減弱, 且無法獲得足夠的碳源合成足夠的反硝化酶系, 影響了菌體的生長以及對硝酸鹽氮或亞硝酸鹽氮的去除[4]; 碳源受到限制時, 好氧反硝化現(xiàn)象消失[27]。

2.4 溶解氧

多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn), 在一定范圍內(nèi), 反硝化率不受 DO值的影響; 當(dāng)DO降低到某個限值時, 隨DO降低反應(yīng)效率迅速升高, 說明 DO存在一個閾值[4]。Pseudomonas stuteri的硝酸鹽還原酶、亞硝酸還原酶和一氧化二氮還原酶的 DO 閾值分別是 5.10、2.50、3.80 mg/L。而Pseudomonas nautica三種還原酶的DO 閾值分別是4.05、2.15、0.25 mg/L。研究表明, 閾值隨著底物、微生物的種類以及環(huán)境條件(溫度、氣壓、離子強度等)不同而不同, DO閾值的范圍一般在0. 08—7. 70 mg/L[8]。此外, Huang, et al.[26]在利用Citrobacter diversus進行好氧反硝化的研究時指出, ρ(DO)為2—6 mg/L對細(xì)菌生長和反硝化最合適。

2.5 pH

環(huán)境中的pH主要作用于細(xì)胞膜的電荷, 影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝過程中酶的活性。?imek, et al.[28]表示, 細(xì)菌生長及反硝化酶活性的最適pH為中性或微堿性, 而cnorB和nirS的表達水平在pH 6—8可保持相對穩(wěn)定[29]。Pseudomonas putida的亞硝酸鹽氮去除率于 pH 6—9時均較高[30]; 而Thioalkalivibrio nitratireducen的亞硝酸鹽還原酶在pH 6.7—7.5范圍內(nèi)活性最高, pH 9—10會抑制其80%的活性, 導(dǎo)致中間產(chǎn)物亞硝酸鹽氮、一氧化氮和一氧化二氮的積累[31]。當(dāng)pH小于5.0時, 生長及反硝化效能都急劇下降; pH為4.0時, 細(xì)菌表面的負(fù)電荷環(huán)境被改變, 營養(yǎng)物質(zhì)難于進入細(xì)胞, 菌株的生長受阻, 基質(zhì)中 H+濃度過高, 酶結(jié)構(gòu)不穩(wěn), 硝酸還原酶活性遭到抑制, 菌株生長和反硝化效能效果均最差[1]。

2.6 其他因素

細(xì)菌生長及反硝化活性最適溫度范圍是 25—35 ℃ ,當(dāng)溫度超過這一范圍時, 均會抑制細(xì)菌生長和反硝化性能[25]。好氧反硝化過程對溫度的耐受性比較好, 在17.5—33.1℃時, 硝酸鹽氮平均去除率大于90%[23]。有研究表明, Pseudomonas putida亞硝酸鹽去除率 20—30℃時的顯著高于15℃[30]。在低溫10—15℃時, 由于菌株胞膜不飽和脂肪酸含量較高, 保證了膜的通透性, 仍具有一定的脫氮能力[1]。

高鹽度對反硝化還原酶活性有一定抑制作用。當(dāng)鹽度范圍在5—15時, 細(xì)菌對亞硝酸鹽氮的去除率接近100%,當(dāng)鹽度超過15 g/L, 細(xì)菌亞硝酸鹽氮去除率逐漸降低[25]。Dincer和Kargi[32]研究表明當(dāng)NaCl濃度超過20 g/L, 硝酸鹽消耗和含氮化合物的脫除效率顯著減少。

反硝化過程包含一些金屬離子為協(xié)作因子的蛋白質(zhì),因此, 金屬對反硝化有顯著影響。添加 Fe3+和 Mo6+能增加 NAR 和 NAP活性[33]; Catarina, et al.[34]研究發(fā)現(xiàn), 60 μg/g Cu可抑制杜羅河沉淀物中85%反硝化過程; Cu的添加還可致使一氧化二氮和亞硝酸鹽氮的積累, 顯著降低了nirK、nirS和nosZ的豐度和酶的多樣性。

在適宜磁場條件下, 磁作用使細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目和線粒體內(nèi)的嵴明顯增加, 為細(xì)胞的呼吸、氧化還原提供足夠的場所, 使能量代謝明顯提高, 水解酶和氧化還原酶活性增強, 提高生物細(xì)胞膜的通透性, 好氧反硝化菌數(shù)量和活性產(chǎn)生明顯變化[3]。當(dāng)磁粉投加量在 0.5—2 g/L,硝酸鹽氮去除率在 93.96%以上, 并隨著磁粉投加量的增加而逐漸上升; 當(dāng)投加量為2 g/L時, 硝酸鹽氮去除率達到 100%; 磁場過強, 會抑制菌株的生長活性, 硝酸鹽氮去除率下降[3]。

3 結(jié)語

養(yǎng)殖水體的富營養(yǎng)化已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)發(fā)展最為突出的問題之一, 利用反硝化菌實現(xiàn)養(yǎng)殖水體生物脫氮已有成功應(yīng)用的報道。陳瑞芳等[35]將一株海水養(yǎng)殖池底泥中分離得到的假單胞菌SF1, 接種到魚池底泥36h后, 底泥的亞硝酸鹽氮去除率達到 67%。張小玲等[36]從土壤中分離出一株反硝化芽孢桿菌 DNF 409, 其硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的降解率可分別達到94.79%和99.94%, 并且在國內(nèi)多個水塘中進行了中試試驗, 均取得了良好的脫氮效果。

利用反硝化細(xì)菌代謝轉(zhuǎn)化去除含氮有害物質(zhì)已成為世界公認(rèn)的最經(jīng)濟有效的綠色途徑之一, 具有重要的研究意義。反硝化酶是反硝化過程中的催化因子, 前人對其結(jié)構(gòu)及其作用機制初步開展了的研究。同時, 綜合影響反硝化速率的限制因素包括: 電子受體、碳源、碳氮比、pH、溶解氧和溫度等, 研究這些限制因素并建立數(shù)學(xué)模型,可以為反硝化脫氮系統(tǒng)的設(shè)計, 提供生物學(xué)參數(shù)。目前雖已取得了不少成果, 但對微生物的反硝化作用還有待進一步深入研究, 主要包括以下幾方面: (1) 反硝化酶功能基因表達的機制研究; (2) 反硝化酶活性的調(diào)控機理; (3)碳源、溫度等環(huán)境因子影響反硝化過程的深入機制。應(yīng)當(dāng)加快反硝化菌作用機理的研究, 以便進一步開發(fā)利用反硝化細(xì)菌, 為生物脫氮提供充分的理論依據(jù)。

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PROGRESS IN STUDIES ON DENITRIFICATION ENZYMES AND ENVIRONMENTAL IMPACT FACTORS

LI Wei-Fen, ZHENG Jia-Jia, ZHANG Xiao-Ping and DENG Bin
(College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

反硝化; 酶; 環(huán)境因子

Denitrification; Enzymes; Environmental factors

Q938.8

A

1000-3207(2014)01-0166-05

10.7541/2014.22

2012-09-17;

2013-06-02

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃(973)項目(2009CB118705); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203083)資助

李衛(wèi)芬(1965—), 女, 江蘇張家港人; 研究員, 博士; 研究方向為微生物與基因工程。E-mail: wfli@zju.edu.cn