孫 琪 胡 鯤 楊先樂

(上海海洋大學, 國家水生動物病原庫, 上海 201306)

殼聚糖對草魚人工感染水霉的影響

孫 琪 胡 鯤 楊先樂

(上海海洋大學, 國家水生動物病原庫, 上海 201306)

水霉病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1,2], 水霉是引起魚類發(fā)生水霉病的主要病原, 其適應溫度范圍廣(5—26 ), ℃ 分布范圍亦很廣[3]。水霉對宿主無嚴格的選擇性[4,5], 除魚卵外, 魚類水霉病均非原發(fā)性疾病, 而是繼發(fā)性疾病[6,7]。當魚類皮膚或鰓受到機械損傷及其他病原體的傷害時, 水霉孢子會在傷口處侵染萌發(fā)。目前國內(nèi)市場上還沒有一種藥物可有效防治水霉病, 防治水霉病成為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的一個重要難題。如何減少水霉病的發(fā)生成為水霉病研究的重要部分。由于水霉是腐生性的, 未受傷的魚不受感染[8,9], 所以促進魚體傷口愈合成為減少水霉病發(fā)生的一條重要途徑。

甲殼素(Chitin)是唯一一種在自然界中大量存在的氨基多糖, 其化學命名為 β-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。殼聚糖(Chitosan)是甲殼素的脫乙酰基產(chǎn)物, 也叫脫乙酰甲殼素, 簡稱(CTS)[10]。甲殼素分布極其廣泛, 大量存在于海洋節(jié)肢動物(如蝦、蟹)的甲殼中, 也存在于昆蟲、藻類細胞膜和高等植物的細胞壁中, 在自然界的儲量僅次于纖維素[11], 每年生物合成的甲殼素有10萬億千克之多。殼聚糖有促進傷口愈合的作用[12], 殼聚糖可促進內(nèi)白細胞殺菌素和巨噬細胞的遷移, 用殼聚糖處理的傷口,可以加速Ⅲ型膠原蛋白的分泌, 從而促進了肉芽組織和上皮組織的形成[13]。Mori, et al.[14]通過鼠體外實驗證明殼聚糖對內(nèi)皮細胞和表皮細胞有趨化性吸引作用, 可以促進纖維母細胞及血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖。Kawakami, et al.[15]通過對小鼠實驗發(fā)現(xiàn)殼聚糖對傷口疼痛有很好的舒緩作用。Allan, et al.[16]發(fā)現(xiàn)殼聚糖與傷口接觸時能起到清涼而舒服的潤膚作用。

殼聚糖已在水處理、日用化學品、生物工程、農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥等領域得到了廣泛的應用[17—19], 在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的研究, 主要以其能增強魚蝦的免疫功能而逐漸引起國內(nèi)外水產(chǎn)工作者的關注[20], 而有關殼聚糖對魚類的其他作用, 如對魚類疾病有無預防、治療效果的研究很少,就其在促進魚類傷口愈合、預防水霉病等作用方面的研究還未涉及。因此, 本研究將殼聚糖添加到受傷草魚以及人工感染水霉草魚的養(yǎng)殖水體中, 研究殼聚糖對草魚傷口愈合以及對人工感染水霉草魚的影響。通過殼聚糖治療魚類體表外傷, 減低魚類感染水霉的概率, 為殼聚糖應用于預防魚類水霉病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

草魚(Ctenopharyngodon idellus), 規(guī)格約為(50±10) g,體長(15±2) cm,購自江蘇省南通國營農(nóng)場, 體表以及解剖觀察健康。200 L玻璃容器, 24h增氧, 水源為已曝氣、消毒自來水, 各項指標均符合漁業(yè)水質(zhì)標準。草魚實驗前暫養(yǎng) 10d, 每天定時投喂飼料 2次, 飼料配制參照 National Research Council(NRC)營養(yǎng)標準。

1.2 實驗試劑

殼聚糖, 純度為90%—95%, 購自上?？ú┕べQ(mào)有限公司; 馬鈴薯葡糖糖瓊脂(PDA), 購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 實驗菌株

水霉菌株為寄生水霉(Saprolegnia parasitica), 購自于 ATCC, 菌株編號: 200013。

1.4 實驗方法

殼聚糖對草魚傷口愈合的影響 取 5個同樣規(guī)格的魚缸(65 cm×40 cm×50 cm, 本實驗均為此規(guī)格魚缸)加入等量已曝氣水, 每個魚缸中分別加入相應量的殼聚糖, 混勻, 使其殼聚糖最終濃度分別為0、12.5、25、50、100 mg/L。

取健康草魚 100條, 在每條草魚一側(cè)背鰭下方的位置, 用刀片劃“ ”Ⅱ 型傷口, 傷口以不出血為標準, 將帶有傷口的草魚隨機地分配到5個魚缸中, 每缸20條。停止投喂, 5d后觀察傷口愈合情況。重復以上實驗3次。

草魚人工感染水霉實驗 挑取保存于試管內(nèi)的水霉菌絲, 轉(zhuǎn)接于馬鈴薯葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA, 配方: 葡萄糖20 g/L, 瓊脂粉20 g/L, 馬鈴薯淀浸出粉15 g/L)培養(yǎng)皿中, 20℃培養(yǎng)72h, 使菌絲長滿整個培養(yǎng)基表面。取20個培養(yǎng)好的培養(yǎng)皿, 將水霉菌連同培養(yǎng)基一起放入過濾網(wǎng)袋中, 放入已曝氣水體中, pH 6.5—6.8, 在水溫20℃的條件下培養(yǎng)水霉, 18h后, 用血球計數(shù)板每隔2h計數(shù)一次水體中孢子數(shù), 直至水體中孢子濃度達到 1×104個/mL,作為感染水體。

取養(yǎng)殖于25℃水溫中健康草魚20條, 用手術刀將其背鰭下方兩側(cè)的鱗片去掉, 刮拭去掉鱗片部位的皮膚約9 cm2, 并用刀片輕微劃傷皮膚, 擦拭掉傷口表面的黏液。

將20條劃傷過的草魚置于感染水體中, 并使水溫在1h內(nèi)下降到15 ℃ , 48h 后開始觀察記錄實驗結(jié)果。重復以上實驗10次。

殼聚糖對水霉菌絲生長的影響 配置濃度分別為0、12.5、25、50、100 mg/L的殼聚糖懸浮液, 分別取5 mL加入 6孔板的相應各孔中, 然后每孔中加入水霉菌塊(5 mm×5 mm)。20℃培養(yǎng)20h后, 觀察水霉菌絲生長情況。每個濃度分別作3組平行實驗。

殼聚糖對草魚人工感染水霉實驗的影響 (1) 感染水體中添加殼聚糖, 對草魚人工感染水霉實驗的影響:實驗組感染水體中含有殼聚糖, 其濃度為25 mg/L, 對照組為已曝氣自來水, pH 6.5—6.8, 用上述草魚人工感染水霉實驗方法, 將劃傷的草魚隨機的放到上述兩組魚缸中,每缸各20條, 48h后開始觀察記錄實驗結(jié)果。重復以上實驗3次。(2) 殼聚糖浸泡受傷草魚后, 對草魚人工感染水霉實驗的影響: 按照草魚人工感染水霉實驗中劃傷魚體的方法處理草魚 40條, 隨機平均分配為兩組, 實驗組水體中加入殼聚糖, 使其濃度為25 mg/L, 對照組為已曝氣自來水, pH 6.5—6.8, 養(yǎng)殖72h后, 進行感染實驗。

用上述草魚人工感染水霉的實驗方法, 對以上兩組草魚進行人工感染, 養(yǎng)殖 48h后, 開始觀察記錄實驗結(jié)果。重復以上實驗3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用 SPSS13.0軟件統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)并進行方差分析(one-way-ANOVA), 差異顯著時采用最小顯著性差異法(Least Significant Difference, LSD)對各組平均樣之間進行多重比較, 數(shù)據(jù)表示為平均值加減標準差(Mean±SD)。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖對草魚傷口愈合的影響

殼聚糖濃度≥25 mg/L時, 對草魚傷口愈合效果顯著,且傷口表面附有黏液(圖 1 a); 對照組草魚傷口紅腫, 未愈合, 甚至傷口有潰爛(圖1 b)。

圖1 草魚傷口愈合情況Fig. 1 The wound healing situation of grass carp

對照組草魚傷口愈合率為1.67%。在水體中添加殼聚糖對草魚傷口愈合率有顯著影響(P＜0.05)。在殼聚糖濃度為50 mg/L時, 草魚傷口愈合率與濃度為100和25 mg/L時的無顯著差異(P＞0.05)(表1)。

2.2 草魚人工感染水霉實驗

10次重復實驗發(fā)現(xiàn), 本實驗方法可成功地完成草魚人工感染水霉, 且有較高的感染率。從表2可看出, 草魚人工感染水霉平均感染率為 84.00%, 且在感染過程中草魚平均死亡率為2.00%, 各實驗組間無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 殼聚糖對水霉菌絲生長的影響

20h后, 對照組水霉菌絲平均長度為7.67 mm。200 mg/L殼聚糖懸浮液中水霉菌絲平均長度與對照組的有顯著差異(P＜0.05), 其他濃度組與對照組無顯著差異(P＞0.05)(表3)。

從表 3中可以看出: 低濃度殼聚糖對水霉菌無直接的抑制或殺滅作用, 在感染水體中添加殼聚糖不會對水霉菌產(chǎn)生直接影響。

2.4 殼聚糖對草魚人工感染水霉實驗的影響

感染水體中添加殼聚糖, 對草魚人工感染水霉實驗的影響 在死亡率相同條件下, 對照組草魚人工感染水霉感染率為86.67%。在感染水體中添加25 mg/L殼聚糖懸浮液時,其感染率為61.67%與對照組有顯著差異(P＜0.05)(圖2)。

表1 不同濃度殼聚糖對草魚傷口愈合影響(n=3)Tab. 1 Effect of different concentrations of chitosan on grass carp wound healing(n=3)

表2 草魚人工感染水霉實驗結(jié)果Tab. 2 The results of artificial infection of saprolegnia on grass carp

表3 20h后不同濃度的殼聚糖中水霉菌絲的長度(n=3)Tab. 3 Hypha length of saprolegnia in different concentrations of chitosan after 20 hours(n=3)

感染前, 殼聚糖浸泡受傷草魚后, 對草魚人工感染水霉實驗的影響 在死亡率相同條件下, 對照組草魚人工感染水霉感染率為86.67%。感染前, 25 mg/L殼聚糖浸泡受傷草魚3d后, 其感染率為43.33%與對照組有顯著差異(P＜0.05)(圖 2)。且未感染的草魚傷口明顯愈合, 且傷口表面附有黏液。

在感染水體中添加25 mg/L殼聚糖懸浮液時, 草魚人工感染水霉感染率為61.67%; 感染前, 25 mg/L殼聚糖浸泡受傷草魚3d后, 其感染率為43.33%。感染前, 25 mg/L殼聚糖浸泡受傷草魚 3d后, 能極顯著的降低其感染率(P＜0.05)。

圖2 草魚人工感染水霉感染率(n=3)Fig. 2 The results of artificial infection of saprolegnia on grass carp with different chitosan treatments(n=3)

3 討論

3.1 傷口愈合

本實驗所用的殼聚糖利用蝦、蟹殼生產(chǎn), 適量添加到受傷魚體養(yǎng)殖水環(huán)境中 5d, 殼聚糖在水體中的濃度達到25 mg/L以上時, 對草魚體表傷口有顯著的愈合作用。Usami, et al.[21]對牛、Okamoto, et al.[22]對狗、Kaoru, et al.[23]對鼠傷口研究均發(fā)現(xiàn)殼聚糖具有很好的促進傷口愈合作用, Graeme, et al.[24]對人體皮膚體外實驗發(fā)現(xiàn)殼聚糖可促進纖維母細胞和角質(zhì)細胞增殖。殼聚糖正被人醫(yī)、獸醫(yī)作為傷口愈合增效加速劑在醫(yī)學界廣泛使用[25], 本實驗首次證實殼聚糖對非哺乳動物體表傷口有愈合作用, 為進一步推廣殼聚糖的應用提供理論依據(jù)。

3.2 人工感染

水霉病作為當今水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)一個較重大難題, 現(xiàn)今還不存在一種可用的特效藥物防治水霉病。因此, 預防水霉病的發(fā)生成為重中之重。通過10次草魚人工感染水霉平行實驗證明: 本方法穩(wěn)定可靠、可重復性高, 可作為草魚人工感染水霉基本方法用于科學研究。

本實驗驗證了低濃度殼聚糖對水霉菌無直接的抑制或殺滅作用, 在感染水體中添加殼聚糖對水霉菌無直接影響。在此基礎上, 分別采用在感染水體中添加25 mg/L的殼聚糖以及感染前用 25 mg/L的殼聚糖浸泡受傷草魚3d, 結(jié)果表明: 草魚人工感染水霉感染率均降低。而感染前用殼聚糖浸泡受傷草魚, 感染率相對更低, 死亡率與對照組無顯著差異, 說明25 mg/L殼聚糖對草魚無毒害作用, 在生產(chǎn)實踐中可用于降低受傷魚類水霉病發(fā)病率,減少經(jīng)濟損失。

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EFFECT OF CHITOSAN ON ARTIFICIAL INFECTION OF GRASS CARP SAPROLEGNIASIS

SUN Qi, HU Kun and YANG Xian-Le
(State Collection Center of Aquatic Pathogen, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

殼聚糖; 水霉; 草魚; 人工感染; 傷口愈合

Chitosan; Saprolegnia parasitica; Ctenopharyngodon idellus; Artificial infection; Wound healing

S941.43

A

1000-3207(2014)01-0180-04

10.7541/2014.24

2012-11-20;

2013-10-25

科技部863課題“新型環(huán)境友好型漁藥的研制與漁藥安全性評價”(2011AA10A216); 上海市科技興農(nóng)重點攻關項目“一種高效無毒防治水霉病制劑的研制”(滬農(nóng)科攻字(2011)第 4-8號); 國家科技基礎條件平臺建設運行項目(2012)資助

孫琪(1987—), 女, 山東威海人; 碩士研究生; 主要從事魚類水霉病研究。E-mail: silviasun1987@163.com

楊先樂, E-mail: xlyang@shou.edu.cn