冷 超，王克臣，周亞東，蘇 鈺，李 明*

（1.東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱學院，哈爾濱 150080）

細胞骨架（Cytoskeleton）是指真核細胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系。細胞骨架的概念有狹義和廣義之分。廣義的細胞骨架包括細胞核骨架、（核內骨架及分裂期染色體骨架和核纖層）、細胞質骨架、細胞膜骨架、細胞外基質，它們在結構上相互連接，形成貫穿于細胞的網(wǎng)架體系。狹義的細胞骨架僅指細胞質骨架。在典型的高等真核細胞中，細胞骨架由三種不同類型的纖維系統(tǒng)構成：微管、中間纖維和微絲[1]。細胞骨架系統(tǒng)是當前細胞生物學研究中最活躍的領域之一，近年來其研究方法多為應用免疫熒光技術標記細胞骨架系統(tǒng)[2-5]，而Pena發(fā)明的考馬斯亮藍染色法[6]，具有簡單、方便、快速和經(jīng)濟的優(yōu)點[7]。本試驗選擇考馬斯亮藍染色法，對1%Triton X-100抽提非骨架蛋白的時間進行了優(yōu)化，制備出了北方三種麻類韌皮纖維細胞骨架（狹義），并進行了初步觀察，一方面為其他麻類纖維細胞骨架制備研究提供參考；另一方面為下一步采用免疫熒光法研究細胞壁加厚機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用了三種北方麻類：亞麻，大麻和青麻，其中亞麻選擇了不同類型的3個品種：RAISA（早熟高纖）、雙亞3號（晚熟高產(chǎn)）、VIMY（油用）。

1.2 方法

參照文獻[8]配制試劑。在亞麻、大麻和青麻開花后期，選取生長良好的代表性植株中部莖段（纖維細胞的次生壁開始加厚），取新鮮的韌皮纖維細胞，立刻進行下列操作：①取材：將上述材料放入盛有6 mmol·L-1PBS的小燒杯中，使其下沉，處理5～10 min；②抽提：吸去PBS，用1%Triton X-100處理20、25、30、40 min（37℃恒溫箱中）；③沖洗：吸去1%Triton X-100，M緩沖液充分洗3次，每次5 min；④固定：室溫3%戊二醛固定20 min；⑤ 沖洗：吸去固定液，6 mmol·L-1PBS洗3次，每次5 min，濾紙吸去殘液；⑥染色：0.2%考馬斯亮藍R250染色20 min；⑦制片：蒸餾水洗2～3次，將標本置于載玻片上，加蓋玻片觀察。在Olympus光學顯微鏡下鏡檢，并在DCE-1數(shù)碼目鏡下照相。

2 結果與分析

2.1 亞麻纖維細胞的細胞骨架

不同時間對細胞骨架圖像的影響很大，當用1%Triton X-100抽提20 min時，RAISA的纖維細胞中仍有少量雜質（見圖版Ⅰ-A），但是抽提40 min時，細胞中只有少量的骨架蛋白存在（見圖版Ⅰ-B），部分骨架也被Triton X-100抽提走。圖版Ⅰ-C、D均為1%Triton X-100抽提30 min，細胞骨架系統(tǒng)清晰可見，后者中可見2個細胞核和纖絲結構。

其他2個亞麻品種雙亞3號和VIMY同樣是被1%Triton X-100抽提30 min效果最好，韌皮纖維細胞骨架系統(tǒng)清晰可見纖絲結構，這種結構也互相結合成網(wǎng)絡（見圖版Ⅱ-A、B）。由圖版Ⅱ-C可知，VIMY被1%Triton X-100抽提20 min時，細胞中的蛋白雜質多，明顯看不出骨架；圖Ⅱ-D為抽提VIMY 40 min，觀察不到其細胞內骨架。

圖版Ⅰ 亞麻RAISA韌皮纖維細胞骨架PlateⅠ Fibre cytoskeleton of flax varieties RAISA

圖版Ⅱ 亞麻雙亞3號、VIMY韌皮纖維細胞骨架PlateⅡ Bast fibre cytoskeleton of flax varieties Shuangya3 and VIMY

2.2 大麻與青麻纖維細胞的細胞骨架

試驗結果顯示對于開花后期的大麻和青麻均為1%Triton X-100抽提30 min效果最好，圖版Ⅲ-A和Ⅲ-B表示不同放大倍數(shù)的大麻韌皮纖維細胞骨架，豐富的纖絲結構清晰可見；圖Ⅲ-C為1%Triton X-100抽提非骨架蛋白30 min，高倍鏡下可見青麻韌皮纖維細胞骨架和圓形的細胞核，為了觀察其細胞核，且由于細胞是三維結構，在顯微攝影時，位于非聚焦面上的纖絲結構就不能被觀察到，從而圖版Ⅲ-C中纖絲結構看起來不夠豐富。抽提40 min后的大麻韌皮纖維細胞骨架同樣有骨架蛋白被抽提，結構不完整，而抽提40 min后的青麻韌皮纖維骨架蛋白被抽提，幾乎看不見細胞骨架（見圖版Ⅲ-D）。

圖版Ⅲ 大麻和青麻韌皮纖維細胞骨架PlateⅢ Fibre cytoskeleton of hemp and abutilon

3 討論與結論

細胞骨架發(fā)現(xiàn)較晚，主要是因為一般電鏡制樣采用低溫（0～4℃）固定，而細胞骨架會在低溫下解聚。直到1963年Slauterback改用戊二醛作固定劑，首次在水螅刺細胞中觀察到微管，此后研究者們便開始了對細胞骨架的探索[9]。盡管目前對細胞骨架系統(tǒng)顯示的研究方法多集中在免疫熒光上，但是考馬斯亮藍染色法也不失為一種簡單、方便、快速和經(jīng)濟的試驗方法。

本研究表明，利用Triton X-100在37℃條件下，抽提開花后期細胞次生壁加厚的麻類韌皮纖維細胞骨架非蛋白時間為30 min較為合適。若時間稍短一點如20 min，在細胞中會有脂質和蛋白質抽提不完全；相反，抽提時間為40 min時就會有骨架蛋白被破壞，使得結構不完整。有研究者對洋蔥細胞骨架制備中發(fā)現(xiàn)，1%Triton X-100抽提非骨架蛋白25 min觀察效果較好[10]，這可能是由于研究材料不同造成的（例如細胞壁厚度不同）。在試驗中也發(fā)現(xiàn)，因為麻類纖維細胞次生壁會不斷的加厚，所以如果取材的階段不同，那么纖維細胞壁厚度就會不同，最終就可能會影響到抽提時間的不一致。在國內尚未見到關于麻類韌皮纖維細胞骨架的研究報道，在此情況下，采用考馬斯亮藍染色法可以快速的了解其細胞骨架系統(tǒng)，掌握對麻類韌皮纖維細胞骨架結構顯示方法。另外，動力學可變性是細胞骨架的一個最大特征。即植物細胞在一定膨壓下擴展或伸長時，細胞壁就會按一定的方向和模式擴張，此時已有的細胞壁構架必須改變，以加入新的細胞壁原料。細胞骨架通過指導細胞壁原料的沉積在植物細胞的生長控制和空間調整中發(fā)揮作用[11]。本試驗應用免疫熒光法研究纖維素微纖絲如何在細胞壁中沉積，即微絲和微管如何影響纖維細胞壁的加厚過程，為今后此方面的研究奠定基礎。

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