方鑫　李海玲　安彩艷

[摘要] 目的 探討鎘誘導(dǎo)豬腎近曲小管上皮細(xì)胞（LLC-PK1）毒性及氧化應(yīng)激在其中的作用。 方法 用不同濃度的氯化鎘刺激細(xì)胞9h和25μmol/L的氯化鎘刺激細(xì)胞不同時(shí)間，采用Formazan 分析細(xì)胞存活率反映鎘對(duì)細(xì)胞的損傷程度；以還原型谷胱甘肽（GSH）為靶點(diǎn)，影響GSH濃度的兩個(gè)試劑BSO和NAC，觀察鎘誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中氧化應(yīng)激的作用。 結(jié)果 隨著氯化鎘染毒時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率下降，同樣，隨著劑量的增加，細(xì)胞的存活率逐漸也下降。同時(shí)BSO加重鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，NAC完全抑制鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。 結(jié)論 氯化鎘對(duì)LLC- PK1細(xì)胞具有明顯的毒性，細(xì)胞損傷是通過(guò)氧化應(yīng)激介導(dǎo)，且與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 氯化鎘；豬腎近曲小管上皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激

[中圖分類號(hào)] R114 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）03-34-03

鎘是主要重金屬環(huán)境污染物，由于其分布廣泛和較長(zhǎng)的生物半衰期（16～33年），導(dǎo)致容易在體內(nèi)肝，腎等重要器官蓄積，從而造成重要器官的損傷，如神經(jīng)退行性病變，肝，肺，腎的功能障礙和血管系統(tǒng)疾病[1-2]。而長(zhǎng)期低劑量接觸鎘主要引起以近曲小管損傷為主要特征的腎臟損害[3]。鎘引起腎細(xì)胞損傷是具體通過(guò)什么機(jī)制，尚未完全清楚。本研究選用豬腎近曲小管上皮細(xì)胞（LLC-PK1）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察了氯化鎘對(duì)該細(xì)胞的毒性效應(yīng)，以及誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞損傷中氧化應(yīng)激所起的作用，為進(jìn)一步闡明鎘誘導(dǎo)腎細(xì)胞損傷機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

小牛血清、消化酶、抗體、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、氯化鎘、D-L-丁硫氨酸-[R]-亞砜亞胺（BSO）等化學(xué)試劑均購(gòu)買于Sigma公司（Tokyo，Japan）。全自酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio-tek，USA），CO2培養(yǎng)箱（Heraeus instruments，Germany）。Olympus IX71型倒置顯微鏡（Olympus，Hachioji-shi，Tokyo，Japan）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

豬的腎小管上皮細(xì)胞系LLC-PK1購(gòu)自American Type Culture Collection（Rockville，MD）。培養(yǎng)液選用胎牛血清（DMEM/F12）培養(yǎng)基加5%小牛血清和雙抗（青霉素和鏈霉素各100U/mL），于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)約90%傳代，每周傳代2～3次。

1.3 Formazan分析

細(xì)胞活性用CCK-8（Dojindo Laboratory，Kumamoto，Japan）試劑來(lái)檢測(cè)。CCK-8試劑中含有WST–8：化學(xué)名稱：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

劑量時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系：細(xì)胞以1.5×105的密度鋪于96孔板中，用DMEM/F12培養(yǎng)基加5%小牛血清，放置于37℃、5% CO2中培養(yǎng)箱中48h后，將培養(yǎng)基換成1%的小牛血清，再用氯化鎘刺激。每孔加CdCl2應(yīng)用液10mmol/L使CdCl2終濃度分別為0、5、15、25、50、75μmol/L，培養(yǎng)9h，并以25μmol/L的終濃度對(duì)細(xì)胞分別染毒0、1、3、6、9、12h，然后每孔加入10μL CCK-8反應(yīng)1h，再用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（）表示。多組均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P<0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 氯化鎘對(duì)LLC-PK1細(xì)胞的毒性作用

采用Formazan分析法測(cè)定細(xì)胞的相對(duì)活性。觀察指標(biāo)是細(xì)胞的存活率。由表1可見(jiàn)：用CdCl2（25μmol/L）刺激細(xì)胞1h與對(duì)照組比較，細(xì)胞存活率沒(méi)有差異，3，6，9，12h各組與對(duì)照組比較，細(xì)胞存活率逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。由表2可見(jiàn)，用不同濃度的鎘細(xì)胞染毒9h后，5μmol/L的氯化鎘對(duì)細(xì)胞有輕度的增殖作用，其細(xì)胞存活率是103.15%，其他劑量組與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著CdCl2濃度的增加，其毒性作用逐漸增大，有劑量-反應(yīng)關(guān)系。

2.2 鎘通過(guò)氧化應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞損傷

研究表明大部分鎘誘導(dǎo)細(xì)胞損傷是由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的[4-5]，因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鎘誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)。用細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點(diǎn)。結(jié)果如表3所示：細(xì)胞分成兩組，一組對(duì)照，一組實(shí)驗(yàn)組加50μmol/L CdCl2培養(yǎng)9h后，用BSO（2.5mmol/L）抑制細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）濃度，處理后實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率為17.53%，明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。相反，用NAC（2.0mmol/L）來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)GSH濃度，處理后可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞存活率沒(méi)有差異見(jiàn)表3。

3 討論

鎘是主要的工業(yè)和環(huán)境污染物之一，腎臟是其作用的主要靶器官。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Formazan分析法測(cè)定細(xì)胞存活率表明鎘對(duì)LLC-PK1細(xì)胞的毒性效應(yīng)有良好的劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系可見(jiàn)氯化鎘作用細(xì)胞9h，已呈現(xiàn)明顯的毒性效應(yīng)，細(xì)胞的存活率已下降（63.53%），見(jiàn)表1，隨著CdCl2濃度或時(shí)間的增加，LLC-PK1細(xì)胞的存活率呈明顯下降趨勢(shì)。但5μmol/L CdCl2刺激細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞有增殖的現(xiàn)象，這與紀(jì)存委等[6]的報(bào)道鎘對(duì)細(xì)胞存在Hormesis效應(yīng)，即在較低濃度時(shí)具有刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，而高濃度時(shí)則對(duì)細(xì)胞有抑制作用，的結(jié)果一致。結(jié)果表明CdCl2對(duì)LLC-PK1細(xì)胞毒性有良好的劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。此結(jié)果與任香梅等[7]結(jié)果一致。endprint

Gennari等報(bào)道，鎘可以促進(jìn)氧自由基的形成[3]和降低細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化物質(zhì)-谷胱甘肽（GSH）的濃度[8]，會(huì)造成多種細(xì)胞損傷。大多數(shù)毒性作用是由氧化應(yīng)激所介導(dǎo)[9-10]。藍(lán)暉翔等研究表明，氯化鎘、氯化汞單獨(dú)及聯(lián)合染毒L02細(xì)胞可引起顯著的DNA損傷。這可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[11]。環(huán)境污染物，包括工業(yè)和日用化工，農(nóng)藥，化肥，重金屬和電離輻射，重金屬，特別是鎘是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要因素。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鎘誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)。用細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點(diǎn)。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是抗氧化劑、巰基保護(hù)劑，也是一種自由基清除劑，研究也顯示，對(duì)急性、亞慢性鎘染毒大鼠肝、腎損傷具有明顯的拮抗和保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同樣，NAC增加細(xì)胞內(nèi)GSH濃度能明顯減輕鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，效果非常明顯，BSO降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度可以加重鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷（表3），此結(jié)果與陽(yáng)光等[13]研究相同。這說(shuō)明鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過(guò)氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系，但其具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，氯化鎘對(duì)LLC-PK1細(xì)胞有明顯毒性，具有很好的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過(guò)氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果為今后研究提供理論依據(jù)，但鎘如何影響細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-11-06）endprint

Gennari等報(bào)道，鎘可以促進(jìn)氧自由基的形成[3]和降低細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化物質(zhì)-谷胱甘肽（GSH）的濃度[8]，會(huì)造成多種細(xì)胞損傷。大多數(shù)毒性作用是由氧化應(yīng)激所介導(dǎo)[9-10]。藍(lán)暉翔等研究表明，氯化鎘、氯化汞單獨(dú)及聯(lián)合染毒L02細(xì)胞可引起顯著的DNA損傷。這可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[11]。環(huán)境污染物，包括工業(yè)和日用化工，農(nóng)藥，化肥，重金屬和電離輻射，重金屬，特別是鎘是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要因素。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鎘誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)。用細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點(diǎn)。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是抗氧化劑、巰基保護(hù)劑，也是一種自由基清除劑，研究也顯示，對(duì)急性、亞慢性鎘染毒大鼠肝、腎損傷具有明顯的拮抗和保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同樣，NAC增加細(xì)胞內(nèi)GSH濃度能明顯減輕鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，效果非常明顯，BSO降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度可以加重鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷（表3），此結(jié)果與陽(yáng)光等[13]研究相同。這說(shuō)明鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過(guò)氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系，但其具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，氯化鎘對(duì)LLC-PK1細(xì)胞有明顯毒性，具有很好的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過(guò)氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果為今后研究提供理論依據(jù)，但鎘如何影響細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-11-06）endprint

Gennari等報(bào)道，鎘可以促進(jìn)氧自由基的形成[3]和降低細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化物質(zhì)-谷胱甘肽（GSH）的濃度[8]，會(huì)造成多種細(xì)胞損傷。大多數(shù)毒性作用是由氧化應(yīng)激所介導(dǎo)[9-10]。藍(lán)暉翔等研究表明，氯化鎘、氯化汞單獨(dú)及聯(lián)合染毒L02細(xì)胞可引起顯著的DNA損傷。這可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[11]。環(huán)境污染物，包括工業(yè)和日用化工，農(nóng)藥，化肥，重金屬和電離輻射，重金屬，特別是鎘是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要因素。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鎘誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)。用細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點(diǎn)。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是抗氧化劑、巰基保護(hù)劑，也是一種自由基清除劑，研究也顯示，對(duì)急性、亞慢性鎘染毒大鼠肝、腎損傷具有明顯的拮抗和保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同樣，NAC增加細(xì)胞內(nèi)GSH濃度能明顯減輕鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，效果非常明顯，BSO降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度可以加重鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷（表3），此結(jié)果與陽(yáng)光等[13]研究相同。這說(shuō)明鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過(guò)氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系，但其具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，氯化鎘對(duì)LLC-PK1細(xì)胞有明顯毒性，具有很好的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過(guò)氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果為今后研究提供理論依據(jù)，但鎘如何影響細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-11-06）endprint