王炎等

[摘要] 目的 探討丹參酮ⅡA多級(jí)靶向納米粒的制備及其工藝優(yōu)化。 方法 采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備丹參酮ⅡA多級(jí)靶向納米粒；考察單因素在納米粒制備過(guò)程中的影響，包括TSⅡA載藥納米粒中的藥物濃度、乳化劑濃度、有機(jī)相/外水相、超聲時(shí)間和強(qiáng)度等的改變；并通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化TSⅡA多級(jí)靶向納米粒的制備工藝。 結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)成功制備了含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級(jí)靶向納米粒，優(yōu)選工藝參數(shù)為：藥物濃度1mg/mL，載體材料濃度20mg/mL，有機(jī)相/外水相為1∶10，超聲強(qiáng)度和時(shí)間分別為200W，20×5s。 結(jié)論 此丹參酮ⅡA多級(jí)靶向納米粒的制備工藝切實(shí)可行。所制備的TNP包封率和載藥量較高，為丹參酮ⅡA的臨床應(yīng)用提供了更廣闊的前景。

[關(guān)鍵詞] 丹參酮ⅡA；載藥納米粒；RGD；腫瘤靶向

[中圖分類號(hào)] TQ461 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）03-09-04

丹參酮ⅡA（Tashinone ⅡA，TSⅡA）為傳統(tǒng)中藥丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）中的有效脂溶性成分。近年來(lái)研究表明，TSⅡA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有明顯的細(xì)胞毒作用[1-2]，但因丹參酮ⅡA難溶于水、體內(nèi)代謝快、生物利用率低等缺點(diǎn)，限制其在臨床上的廣泛應(yīng)用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA聚乳酸載藥納米粒（TSⅡA-PLA NPs）對(duì)肝癌有較好療效[3-5]。本研究采用乳化溶劑蒸發(fā)法，制備含

RGD修飾的丹參酮ⅡA多級(jí)靶向納米粒（TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD NPs），可以增加藥物半衰期，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間，同時(shí)顯著提高對(duì)腫瘤的靶向作用。

1 儀器與材料

1.1 試劑

丹參酮ⅡA對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110766-200417，純度99.3%）；Poloxamer188（德國(guó)BASF公司）；mPEG-PLGA-PLL、mPEG-PLGA-PLL-cRGD（上海市腫瘤研究所段友容課題組提供）；吉非羅齊（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100284-199801）；甲醇為色譜醇；其他試劑為分析純。

1.2 主要儀器

激光粒度散射儀（Nicomp 380/ZLS，美國(guó)）；紫外分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendorf公司）；微量電子分析天平（Sartotius CP225D）； Centrifuge 5804R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；質(zhì)譜儀（API 3000，美國(guó)ABI公司）；XW-80A 型旋渦混合儀（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 丹參酮ⅡA多級(jí)靶向納米粒制備

將含RGD修飾的空白納米粒溶解于TSⅡA二氯甲烷溶液（0.8mg/mL）中，取mPEG-PLGA-PLL-cRGD（濃度20mg/mL）200μL，加入0.5%的乳化劑F-68的水溶液10mL，進(jìn)行超聲乳化。隨后將制備的納米粒溶液置入燒杯中，攪拌揮發(fā)有機(jī)溶劑，即得丹參酮ⅡA多級(jí)靶向納米粒[6]。

2.2 藥物濃度測(cè)定方法

2.2.1 HPLC檢測(cè)的色譜條件 色譜柱為Zorbax XDB-C18（150mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-水（85︰15），流速為1mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，進(jìn)樣量為20μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取TSⅡA 5mg，置250mL的量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并定容，作為丹參酮對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋，得濃度為0.001，0.01，0.1，0.5，1，2，5，8，10，20μg /mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線由濃度（Concentration）對(duì)峰面積（Peak area）做線性回歸所得。

2.2.3 單因素考察 改變載藥納米粒中的藥物濃度，載體濃度，乳化劑濃度，有機(jī)相與外水相體積比，超聲強(qiáng)度和超聲時(shí)間等條件，制備丹參酮ⅡA多級(jí)靶向載藥納米粒，考察單因素對(duì)載藥納米粒的影響，篩選出較優(yōu)的工藝參數(shù)。

2.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)2.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)載藥納米粒粒徑大小、包封率、載藥量影響較大的四個(gè)因素，分別為：藥物/材料，乳化劑F-68濃度，有機(jī)相與外水相體積比和超聲次數(shù)，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。綜合評(píng)價(jià)各因素的影響，確定最佳的載藥納米粒的處方和工藝。

3 結(jié)果

3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線以藥物濃度（Concentration）對(duì)峰面積（Peak area）做線性回歸，見(jiàn)圖1。

3.2 單因素考察

3.2.1 藥物濃度 在實(shí)驗(yàn)中如選用較低的TSⅡA藥物濃度時(shí)，載藥納米粒包封率會(huì)比較高，但載藥量會(huì)隨之降低，而選用較高的TSⅡA藥物濃度時(shí)載藥納米粒的包封率又會(huì)隨之降低。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇的最佳TSⅡA濃度為1mg/mL。

3.2.2 載體材料濃度 其他條件相同時(shí)，如想提高包封率，可增加載體材料的濃度，使平均分配到每個(gè)載藥納米粒載體上的藥物減少。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇的載體濃度是20mg/mL。見(jiàn)表1。

3.2.3 有機(jī)相/外水相體積比（O/W） O/W體積比能夠影響載藥納米粒的粒徑，O/W減少，納米粒的粒徑會(huì)增大，O/W增大，納米粒的粒徑會(huì)減小。綜合本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，選擇較合適的O/W為1︰10。

3.2.4 超聲時(shí)間 超聲時(shí)間對(duì)粒徑大小和包封率影響不大，本實(shí)驗(yàn)中選擇的超聲時(shí)間為20×5s。

3.2.5 超聲強(qiáng)度 選擇適當(dāng)?shù)某晱?qiáng)度在制備載藥納米粒的過(guò)程中非常重要，超聲強(qiáng)度過(guò)大容易導(dǎo)致載藥納米粒被破壞；功率太小又會(huì)導(dǎo)致載藥納米粒粒徑較大且分散不均勻。綜合本實(shí)驗(yàn)中所制備的TSⅡA載藥納米粒包封率及載藥量等各項(xiàng)數(shù)據(jù)，選擇超聲強(qiáng)度為200W。endprint

3.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化制備工藝

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)：以包封率為指標(biāo)的最佳工藝為A2B2C2D1，影響的顯著性為D>C>B>A，其中D藥物-材料比例具有顯著性影響；以載藥量為指標(biāo)的最佳工藝為A2B1C2D2，影響的顯著性為C>D>B>A，影響無(wú)顯著性。由于D1和

D2水平時(shí)載藥量結(jié)果相差不大，但包封率的結(jié)果相差很大，并且該因素對(duì)于包封率具有顯著性影響，因此選擇D1；B1和B2水平時(shí)載藥量的結(jié)果相差不大，包封率的結(jié)果相差也不大，但對(duì)于包封率的影響大于載藥量，因此選擇D2。而因此確定最佳工藝為A2B2C2D1，即mPEG-PLGA-PLL 20mg，加0.8mg/ml的丹參酮二氯甲烷溶液1mL溶解，加10mL 0.5% F-68溶液，冷水浴超聲（200W）40s×10次，室溫?cái)嚢璩ザ燃淄椋?000r/min×5min離心除沉淀，即得納米粒水分散體。見(jiàn)表2。

4 討論

目前在臨床上對(duì)腫瘤的藥物治療想達(dá)到的效果主要是使腫瘤局部的藥物濃度盡可能達(dá)到最大化，以期達(dá)到增效減毒的作用。隨著對(duì)納米技術(shù)的運(yùn)用，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)納米粒包裹藥物制備成載藥納米粒后，藥物具有較好的靶向作用，可以使藥物在腫瘤中得到蓄積，因此得到了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)納米載體包裹制備的新型藥物劑型，有如下的一些優(yōu)點(diǎn)和特性：（1）提高藥物的生物利用度[7-8]；（2）增強(qiáng)藥物的腫瘤靶向性[9-10]；納米粒徑的改變可使藥物到達(dá)體內(nèi)不同的部位，并使藥物在肝臟和腫瘤中得到蓄積；（3）具有較好的控（緩）釋性，載藥納米粒在進(jìn)入體內(nèi)后，藥物可以從納米材料中釋緩慢釋放出來(lái)，避免了“暴釋效應(yīng)”[11-12]。另外，載藥納米粒可以有效的增加藥物半衰期，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，與游離藥物相比抗腫瘤效果得到進(jìn)一步提高 [13-15]。

本實(shí)驗(yàn)采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級(jí)靶向納米粒，該制備方法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，并有較好的可重復(fù)性。優(yōu)選工藝參數(shù)為：藥物濃度1mg/mL，載體材料濃度20mg/mL，O/W為1∶10，超聲強(qiáng)度和時(shí)間分別為200W， 20×5s。

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