鮑兆祥,張 雪, 高 燦
(1.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省腦病生物信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 徐州221004; 2.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 徐州 221004)
阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,簡稱AD),是一組病因未明的原發(fā)性退行性腦變性疾病,是老年人最為常見的癡呆類型.隨著社會的老齡化,該病已成為現(xiàn)代社會老年人的主要致死疾病之一.因而,研究老年癡呆疾病早期認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制,對預(yù)防和早期治療AD更具有臨床意義和社會價(jià)值.在AD病人的大腦中Aβ的總量是增加的,且其含量的高低與學(xué)習(xí)記憶的損傷有密切的關(guān)系.而這其中Aβ1-42具有高的疏水性,且更容易在細(xì)胞外聚集[1].因此,Aβ1-42是體外模擬AD疾病模型最常用的Aβ小肽.Aβ是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)在β- 和γ- 分泌酶相繼作用后產(chǎn)生的.早期認(rèn)為Aβ沉積形成的淀粉樣纖維是介導(dǎo)神經(jīng)元死亡的主要病因[2,3].但是大量臨床證據(jù)表明AD的認(rèn)知功能障礙在淀粉樣纖維形成之前就有發(fā)生,淀粉樣纖維并不能解釋AD病人的認(rèn)知障礙.Oda等人[4]的研究表明是可溶性的Aβ聚集體而不是Aβ纖維在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用.Aβ寡聚體最初是被 Roher等人在1991年時(shí)發(fā)現(xiàn)的,直到1998年由Lambert等人將Aβ來源的擴(kuò)散性配體(Aβ-derived diffusible ligands)稱為ADDLs[5],即具有神經(jīng)毒性的可溶性、非纖維化、具有配體結(jié)合特征的Aβ寡聚體.近年來越來越多的研究表明,ADDLs,這種可溶性的寡聚體作為AD發(fā)病的關(guān)鍵分子,在突觸可塑性改變和隨后的記憶功能損傷及認(rèn)知功能障礙方面的作用已被廣泛接受[3,5,6].現(xiàn)在被普遍接受的寡聚體假說認(rèn)為:Aβ升高增加了ADDLs的形成,ADDLs和相關(guān)受體以高度親和力相結(jié)合,進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生突變信號——一方面阻斷LTP導(dǎo)致記憶受損,另一方面持久作用于下游信號通路,導(dǎo)致神經(jīng)元損傷死亡[3].
N-甲基-D-天冬氨酸 (N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體作為突觸后興奮性谷氨酸受體,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用.現(xiàn)在研究證明NMDA受體不僅存在于突觸上,而且還存在于突觸外位點(diǎn).突觸外的NMDA受體作為一種儲備受體,當(dāng)突觸上的NMDA受體功能發(fā)生障礙時(shí),突觸外儲備的NMDA受體就會通過側(cè)向的擴(kuò)散進(jìn)入突觸后位點(diǎn),補(bǔ)償由于功能障礙而損失的NMDA受體,進(jìn)而使得突觸正常發(fā)揮其生理功能[7,8].關(guān)于突觸外的NMDA受體的功能,一種觀點(diǎn)認(rèn)為突觸外的NMDA受體與突觸上的NMDA受體有著截然相反的功能,突觸上的NMDA受體介導(dǎo)著細(xì)胞的存活,而突觸外的NMDA受體介導(dǎo)著細(xì)胞的死亡[9].
細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)是細(xì)胞內(nèi)重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,p-ERK1/2是其活性形式[10].ERK1/2的底物包括細(xì)胞內(nèi)其他重要的激酶、轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白以及K+通道等,這些物質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的重要組成成分,在學(xué)習(xí)記憶形成過程中必不可少,同時(shí)ERK1/2可能參與了神經(jīng)元形態(tài)學(xué)可塑性的形成過程[11,12].在細(xì)胞內(nèi),ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以被多種途徑激活,其中主要的有Ca2+途徑,AC/cAMP/PKA途徑,NMDA受體途徑,受體酪氨酸激酶途徑,G蛋白耦聯(lián)受體途徑等[12,13].目前,關(guān)于NMDA受體途徑如何激活ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究受到眾多學(xué)者的認(rèn)可.研究表明NMDA受體可以通過多種方式激活ERK1/2信號通路,如受體活化后引起的Ca2+內(nèi)流.而且Ras和MAPK/ERK1/2三級級聯(lián)反應(yīng)中,Raf-1、MEK、ERK1/2是NMDA受體復(fù)合體的主要組成成分[11~13].NMDA受體對ERK1/2信號通路的調(diào)節(jié)作用不但對突觸活動產(chǎn)生神經(jīng)性應(yīng)答,而且對認(rèn)知功能以及神經(jīng)可塑性都有重要作用[12~14].
有觀點(diǎn)認(rèn)為突觸上的NMDA受體的激活引起了ERK1/2的激活,ERK1/2磷酸化后與下游物質(zhì)發(fā)生一系列反應(yīng),之后被長距離運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi),從而發(fā)揮作用[15].雖然該理論已經(jīng)被廣泛接受,但是也有人對此持不同的觀點(diǎn).激活突觸外的NMDA受體會使Ras失活[16],失活的Ras也就無法使其下游底物ERK1/2磷酸化激活,進(jìn)而使得ERK1/2無法向核內(nèi)轉(zhuǎn)位作用其下游底物CREB.那么,ADDLs是否會對ERK1/2信號通路產(chǎn)生影響?ERK1/2信號通路是否受到NMDA受體的調(diào)節(jié),到底是突觸上的NMDA受體還是突觸外的NMDA受體發(fā)揮更重要作用?ADDLs對NMDA受體的影響與ADDLs對ERK1/2信號通路產(chǎn)生的影響是否存在某種內(nèi)在的聯(lián)系?
本文通過細(xì)胞和整體水平研究,闡明ADDLs 對ERK1/2信號通路影響的機(jī)制,揭示ADDLs影響突觸可塑性導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制.本研究將拓寬研究AD疾病的新思路,并為基于ERK1/2信號通路及突觸可塑性的神經(jīng)保護(hù)治療和藥物研發(fā)提供新的靶點(diǎn).
1.1.1 ADDLs對ERK1/2磷酸化水平的影響
為了研究ADDLs對ERK1/2信號通路的影響,在培養(yǎng)的18~20 d的大鼠海馬神經(jīng)元上,給予500 nmol/L ADDLs,分別作用了1 h, 3 h, 6 h, 24 h.我們首先應(yīng)用免疫印跡的方法檢測了ERK1/2磷酸化水平的變化情況,結(jié)果顯示給于ADDLs 3 h, 6 h, 24 h均明顯降低了ERK1/2磷酸化水平.其中在6 h ERK1/2的磷酸化水平降到最低,24 h有所回升.
1.1.2 ADDLs對細(xì)胞不同部位ERK1/2磷酸化水平的影響
ERK1/2信號通路激活會導(dǎo)致ERK1/2的磷酸化,磷酸化的ERK1/2可以向核內(nèi)轉(zhuǎn)位[17],作用于核內(nèi)的下游信號分子,從而發(fā)揮重要作用.那么ADDLs是否會對ERK1/2的這種轉(zhuǎn)位活動產(chǎn)生影響呢?為此以培養(yǎng)20 d的原代海馬神經(jīng)元為材料,利用組分提取試劑盒,分別得到了海馬神經(jīng)元不同的組分蛋白——細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核,免疫印跡結(jié)果顯示,ADDLs對細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核中ERK1/2磷酸化水平的影響在時(shí)間上呈現(xiàn)明顯的差異.ADDLs作用1 h后明顯降低了細(xì)胞質(zhì)中ERK1/2磷酸化水平,但是細(xì)胞膜中ERK1/2磷酸化水平在6 h才出現(xiàn)顯著性降低,而細(xì)胞核中則需要24 h才有顯著性降低的表現(xiàn).
研究表明,激活突觸外的NMDA受體會使Ras失活[16],失活的Ras也就無法使其下游底物ERK1/2磷酸化激活,進(jìn)而使得ERK1/2無法向核內(nèi)轉(zhuǎn)位作用其下游底物CREB.在前言中也提到GluN2B亞基主要分布在突觸外膜上,那么ADDLs是否通過突觸外NMDA受體影響ERK1/2信號通路?在培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元上,按高燦等人已建立的方法[18],選擇加入NMDA 20 μmol/L、Gly 20 μmol/L激活5 min,制作激活突觸外的NMDA受體的細(xì)胞模型.IB結(jié)果顯示,單獨(dú)激活突觸外的NMDA受體和給予ADDLs后再激活突觸外的NMDA受體,ERK1/2的磷酸化水平均明顯降低,沒有顯著性差異.這說明ADDLs通過突觸外受體影響ERK1/2信號通路.
將飼養(yǎng)至9個(gè)月的轉(zhuǎn)入APP(淀粉樣前體蛋白)基因的AD模型小鼠(簡稱APP小鼠),按基因型分為WT(野生型)組和APP組,進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn).小鼠連續(xù)接受5天訓(xùn)練,每天4 次,每次在平臺上逗留30 s, 記錄小鼠分別從4個(gè)象限不同入水點(diǎn)入水找到平臺所需的時(shí)間,即潛伏期(escaping latency).4 次潛伏期成績的平均值作為當(dāng)日最終成績進(jìn)入最后統(tǒng)計(jì).如果小鼠在90 s 內(nèi)未找到平臺,其潛伏期按90 s 計(jì)算.記錄小鼠每天在平臺所在象限即目的象限(target quadrant)停留的時(shí)間.第6天撤除平臺,從任一入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中,記錄90 s 內(nèi)小鼠的游泳軌跡并進(jìn)行分析.觀察分析小鼠停留各象限的時(shí)間百分比.迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī),計(jì)算機(jī)自動跟蹤計(jì)時(shí)并記錄游泳軌跡,Anymaze軟件分析結(jié)果.水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示APP小鼠比野生型的小鼠要花更長的時(shí)間才能找到目標(biāo)平臺,說明APP小鼠的學(xué)習(xí)記憶已經(jīng)受損.
APP小鼠是目前比較常用的用于研究AD的實(shí)驗(yàn)動物,由于該小鼠轉(zhuǎn)入了APP基因,所以其大腦中能夠產(chǎn)生大量的Aβ,且Aβ能夠在細(xì)胞外寡聚化進(jìn)而形成ADDLs,而ADDLs是目前認(rèn)為的損傷學(xué)習(xí)記憶的主要元兇之一.分別將WT與APP組實(shí)驗(yàn)小鼠深度麻醉斷頭取海馬進(jìn)行樣品的處理,進(jìn)行免疫印記分析.結(jié)果顯示,APP小鼠ERK1/2的磷酸化水平顯著降低.
AD的主要癥狀是記憶喪失,雖然目前有一些關(guān)于ADDLs如何最終損傷學(xué)習(xí)記憶的研究,也有很多有意義的研究結(jié)果,但是依然有很多機(jī)制有待去了解.MAPK/ERK信號通路與腦內(nèi)長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的形成以及學(xué)習(xí)記憶功能的重要聯(lián)系一直是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn).研究結(jié)果表明,ERK1/2可以通過多種方式影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)信息的長期存儲[11~13],如ERK1/2調(diào)控海馬神經(jīng)元樹突棘結(jié)構(gòu)的形成與變化;ERK1/2可直接參與調(diào)控樹突蛋白合成,且此蛋白合成為LTP形成及記憶功能所必需;ERK1/2與突觸結(jié)構(gòu)蛋白(如腳手架蛋白)的相互作用共同參與突觸和神經(jīng)元的可塑性改變,最終影響學(xué)習(xí)記憶功能.研究結(jié)果顯示,ADDLs以時(shí)間依賴的方式抑制ERK1/2磷酸化水平.
ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為是細(xì)胞外多種刺激傳向細(xì)胞內(nèi)的交匯點(diǎn)[14].在細(xì)胞內(nèi)能引起ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的路徑主要有[11~13]:Ca2+途徑;AC/cAMP/PKA途徑;NMDA受體途徑;受體酪氨酸蛋白激酶途徑;G蛋白耦聯(lián)受體途徑.其中NMDA受體途徑被研究的最為廣泛.NMDA受體激活引起的Ca2+內(nèi)流激活ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,一直以來都是人們研究的熱點(diǎn).另外,Ras、MERK1/2/ERK1/2三級級聯(lián)反應(yīng)中的Raf-1、MEK、ERK1/2是NMDA受體復(fù)合體的主要組成成分.受體酪氨酸蛋白激酶是催化NMDA受體發(fā)揮生物學(xué)功能的主要激酶.NMDA受體必須通過相關(guān)腳手架蛋白錨定于突觸后膜上[19].突觸內(nèi)與突觸外的NMDA受體有著不同的結(jié)構(gòu)組成以及介導(dǎo)了不同的下游通路:激活突觸內(nèi)的NMDA受體促進(jìn)細(xì)胞存活,而激活突觸外的NMDA受體導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14,20].早在1991年Bading等[14]報(bào)道了NMDA受體介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流激活了ERK1/2,而這一過程是Ras依賴的,而激活突觸外的NMDA受體會使Ras失活[20,21],失活的Ras也就無法使其下游底物ERK1/2磷酸化激活.此外,當(dāng)突觸上的NMDA受體與突觸外的NMDA受體同時(shí)被激活時(shí),突觸外的NMDA受體激活產(chǎn)生的效應(yīng)占主導(dǎo)地位[22].研究結(jié)果顯示,當(dāng)特異性激活突觸外NMDA受體,與對照組相比ERK1/2磷酸化水平明顯降低.給予ADDLs(500 nmol/L)3 h后再激活突觸外NMDA受體,ERK1/2的磷酸化水平較單獨(dú)激活突觸外NMDA受體組相比,具有更加明顯的降低.說明ADDLs可能通過過度激活了突觸外的NMDA受體,抑制了ERK1/2信號通路的激活.另外,我室前期研究結(jié)果表明,當(dāng)GluN2B的特異性抑制劑Ro-256981與ADDLs聯(lián)合給藥時(shí),ERK1/2的磷酸化水平較單獨(dú)給予ADDLs組得到了恢復(fù),而Ro-256981本身并不影響ERK1/2的磷酸化水平.結(jié)合下面的觀點(diǎn):在突觸發(fā)生階段,突觸外NMDA受體主要由GluN2B組成,但不包含GluN2A;隨著神經(jīng)元的成熟,突觸外NMDA受體的組成基本不變,此時(shí)突觸上NMDA受體則主要由GluN2B逐漸轉(zhuǎn)化為GluN2A[23~25].可以得到這樣一個(gè)結(jié)論:ADDLs通過過度激活了突觸外的NMDA受體,抑制了ERK1/2信號通路的激活.
激活的 ERK 可能有 3 種去向[26]:1)停留在胞質(zhì)中,激活一系列其他蛋白激酶;2)在胞質(zhì)中使細(xì)胞骨架成分磷酸化; 3)進(jìn)入細(xì)胞核,通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控基因的表達(dá)最終介導(dǎo)細(xì)胞的生長、分化、遷移、侵襲等多種過程.那么ADDLs通過過度激活了突觸外的NMDA受體,抑制的ERK1/2信號通路發(fā)揮作用是否具有特異性?研究結(jié)果顯示,ADDLs對細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核中ERK1/2磷酸水平的影響在時(shí)間上呈現(xiàn)明顯的漸進(jìn)性.ADDLs作用1h后明顯降低了細(xì)胞質(zhì)中ERK1/2磷酸化水平,但是細(xì)胞膜中ERK1/2磷酸化水平在6 h才出現(xiàn)顯著性降低,而細(xì)胞核中則需要24 h才有顯著性降低的表現(xiàn).說明ADDLs對ERK1/2信號通路的影響在時(shí)間和空間上均有不同,即ADDLs對ERK1/2信號通路的影響是有一定的時(shí)序性.這也提示了作為多種信號通路的匯集點(diǎn),ERK1/2信號傳導(dǎo)是非常精確和復(fù)雜的.
ADDLs影響學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制是復(fù)雜的,其中絕大多數(shù)機(jī)制是不明確的.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ADDLs通過過度激活了突觸外的NMDA受體,抑制了ERK1/2信號通路的激活,而ADDLs對ERK1/2信號通路的影響具有一定的時(shí)序性.ADDLs在抑制該通路的同時(shí)也可能抑制了其他有助于學(xué)習(xí)記憶形成與鞏固的通路,這些通路有的是已知的,然而絕大多數(shù)是未知的.筆者僅對該通路進(jìn)行了觀測,研究結(jié)果僅表明ADDLs通過過度激活了突觸外的NMDA受體,抑制了ERK1/2信號通路的激活,是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力降低的可能原因之一.希望本研究為研究AD學(xué)習(xí)記憶損傷提供一個(gè)新的思路和方向,為將來AD的治療提供理論基礎(chǔ).
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