柳忠玉趙樹(shù)進(jìn)

（1. 長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣州 510010）

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的虎杖莖尖轉(zhuǎn)化研究

柳忠玉1趙樹(shù)進(jìn)2

（1. 長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣州 510010）

為了建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系，以虎杖的莖尖為轉(zhuǎn)化受體，研究了攜帶白藜蘆醇合酶基因（PcRS）的根癌農(nóng)桿菌載體介導(dǎo)的虎杖遺傳轉(zhuǎn)化若干因素對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響。結(jié)果顯示，較適宜的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為預(yù)培養(yǎng)2 d，農(nóng)桿菌菌液（OD600值為0.6）侵染10 min，共培養(yǎng)3 d，在含8 mg/L 潮霉素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽。利用該體系從 300 塊莖尖外植體中共轉(zhuǎn)化獲得 15株抗性再生植株，經(jīng) PCR 和 Southern 雜交檢測(cè)，有 6 株虎杖的基因組中已整合進(jìn)了目的基因。

虎杖 莖尖 根癌農(nóng)桿菌 遺傳轉(zhuǎn)化

虎杖（Polygonum cuspidatumSieb. et Zucc.）是蓼科多年生草本植物，根或根莖入藥?；⒄雀泻写罅烤哂兄委熜в玫拇渭?jí)代謝物，如白藜蘆醇、虎杖苷、蒽醌類(lèi)等。其中白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)心血管系統(tǒng)等廣泛的生物學(xué)功能［1-3］?；⒄纫讶〈咸?，成為最重要的白藜蘆醇藥源植物。

盡管虎杖具有重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但其分子遺傳和基因組的研究仍十分缺乏。最近，郝大程等［4］利用測(cè)序技術(shù)分析虎杖根轉(zhuǎn)錄組特性，識(shí)別出與白藜蘆醇、蒽醌及其糖苷生物合成有關(guān)的基因，并且發(fā)現(xiàn)大量序列代表轉(zhuǎn)座子（TEs）和單重復(fù)序列（SSRs），這些結(jié)果有望用于虎杖植株的遺傳改良。在白藜蘆醇的生物合成途徑中，白藜蘆醇合酶是一個(gè)關(guān)鍵限速酶，在植物中過(guò)量表達(dá)該基因可以提高白藜蘆醇含量或增強(qiáng)植物抗逆性［5］。建立快速高效的虎杖遺傳轉(zhuǎn)化體系顯得尤為迫切，但是當(dāng)前關(guān)于虎杖遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究仍未深入和系統(tǒng)?，F(xiàn)有的研究表明，虎杖是含酚類(lèi)物質(zhì)較多的藥用植物，其愈傷組織誘導(dǎo)率低并且基部易褐化，不利于進(jìn)一步的生長(zhǎng)及分化［6］。利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)虎杖毛狀根的產(chǎn)生，能提高毛狀根中活性成分含量，但存在陽(yáng)性毛狀根生長(zhǎng)緩慢，容易褐化等問(wèn)題［7，8］。利用植物莖尖為轉(zhuǎn)化受體，不必經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)愈傷及分化成苗階段，轉(zhuǎn)化后可以直接成苗，莖尖轉(zhuǎn)化已成功用于單子葉或雙子葉植物，如小麥、棉花、玉米、太子參和高粱等［9-13］，而以虎杖莖尖為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以虎杖莖尖為轉(zhuǎn)化受體，研究不同因素對(duì)莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的影響，以期為利用虎杖莖尖建立優(yōu)良的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)奠定重要的技術(shù)基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)，并為今后虎杖基因的分子生物學(xué)研究和品種改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 虎杖植株由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心提供。

1.1.2 載體和菌株 本研究所用植物過(guò)量表達(dá)載體pCAMBIA1380-35S-PcRS為筆者構(gòu)建［14］，含有虎杖白藜蘆醇合酶基因PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase）和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。根癌農(nóng)桿菌EHA105由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物基因組學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方 誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS + 0.05 mg/L TDZ（Thidiazuron，苯基噻二唑基脲）+ 0.5 mg/L NAA（naphthlcetic acid，萘乙酸），pH5.8。共培養(yǎng)基：MS+ 0.05 mg/L TDZ + 0.5 mg/L NAA + 40 mg/L AS（Acetosyringone，乙酰丁香酮），pH5.5。篩選培養(yǎng)基：MS+ 0.05 mg/L TDZ + 0.5 mg/L NAA + 6 mg/L Hyg（hygromycin，潮霉素），pH5.8。增殖培養(yǎng)基：MS + 0.1 mg/L CPPU（N-（2-chloro-4-pyridyl）-N'-phenylurea，氯吡苯脲）+ 1.0 mg/L NAA + 6 mg/L Hyg，pH5.8。根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS +1.0 mg/L NAA + 0.5% 活性炭，pH5.8。

1.2.2 虎杖無(wú)菌苗的獲得與莖尖外植體制備 將虎杖嫩莖剪成長(zhǎng) 5 cm左右的莖段，沖洗約1 h，移到超凈工作臺(tái)上，用 70%的乙醇消毒 30 s，1.5%次氯酸鈉振蕩洗滌 20 min，再用無(wú)菌水沖洗 4-5遍。然后切取帶腋芽的莖段 1 cm左右，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的生長(zhǎng)。將誘導(dǎo)形成的叢生芽分離成單個(gè)芽，繼續(xù)培養(yǎng)成苗。取虎杖無(wú)菌試管苗放到解剖顯微鏡下，剝掉生長(zhǎng)點(diǎn)附近包裹的葉片，當(dāng)莖尖裸露出來(lái)后用接種針輕輕劃傷頂端分生組織，然后把附帶有莖尖的0.5 cm左右長(zhǎng)的莖段切下來(lái)備用。

1.2.3 虎杖莖尖潮霉素敏感性試驗(yàn) 在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加潮霉素，將潮霉素的濃度設(shè)為0、2、4、8、15 和 30 mg/L 共 6 個(gè)水平，每個(gè)處理接入 100個(gè)虎杖莖尖外植體，試驗(yàn)重復(fù) 3 次，培養(yǎng) 15 d，觀察外植體的色澤變化、生長(zhǎng)狀態(tài)和存活情況。

1.2.4 轉(zhuǎn)化條件的選擇 分別在保持其他因素相同的條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，評(píng)價(jià)各因素對(duì)農(nóng)桿菌侵染虎杖莖尖的影響效果，以確定最佳的侵染條件。將處理好的虎杖莖尖在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng) 1-8 d。將農(nóng)桿菌懸浮液OD600值調(diào)整為 0.2-0.8，侵染經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的莖尖受體5-25 min。侵染結(jié)束后用滅菌濾紙吸干多余菌液，置于墊有一張滅菌濾紙的共培養(yǎng)基上，黑暗中共培養(yǎng) 2-5 d。共培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，將篩選獲得的抗性芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基生長(zhǎng)至 3-5 cm高，再轉(zhuǎn)至根誘導(dǎo)培養(yǎng)基使其長(zhǎng)成完整植株。侵染后受體在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光/暗為 16 h/8 h，溫度 22-25℃。所有試驗(yàn)均為每個(gè)處理檢測(cè) 100 個(gè)莖尖，重復(fù) 3次。采用潮霉素抗性芽的分化率（%）和增殖系數(shù)作為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化效果的指標(biāo)，其計(jì)算方法如下：

分化率（%）= 再生抗性芽的莖尖數(shù)/ 接種莖尖數(shù)×100%

增殖系數(shù)= 莖尖再生抗性芽總數(shù)/ 再生抗性芽的莖尖數(shù)

1.2.5 轉(zhuǎn)基因虎杖的PCR檢測(cè) 用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因虎杖和野生型虎杖的葉片基因組DNA。用潮霉素基因特異引物HPTf（5'-CGCCGATGGTTTCTACAA-3'）和HPTr（5'-GGCGTCGGTTTCCACTAT-3'）進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 預(yù)變性 2 min；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，共28個(gè)循環(huán)；最后 72℃ 延伸 10 min。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為500 bp。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交 對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株和野生植株，取 30 μg虎杖基因組DNA，經(jīng)EcoR I 酶切DNA，以引物HPTf和HPTr擴(kuò)增的潮霉素基因?yàn)樘结樐０?，用地高辛隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。按照文獻(xiàn)［14］方法進(jìn)行Southern雜交。

2 結(jié)果

2.1 虎杖莖尖對(duì)潮霉素的敏感性

本研究以潮霉素作為篩選標(biāo)記，為有效篩選抗性苗，將制備的莖尖分別置于不同濃度梯度的潮霉素培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，觀察外植體的色澤變化、生長(zhǎng)狀態(tài)和存活情況，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。從表1和圖1結(jié)果可以看出，對(duì)照組的虎杖莖尖生長(zhǎng)迅速，并分化出綠色的芽，芽的存活率為 95.6 %；隨著潮霉素濃度的增高外植體生長(zhǎng)減緩，分化出的芽弱小且存活率逐漸降低至 23.7%；高濃度潮霉素處理造成植物組織失綠褐化并迅速死亡。當(dāng)潮霉素濃度在4 mg/L 以下不能有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，容易造成大量非轉(zhuǎn)化體的逃逸；潮霉素濃度在 15 mg/L以上時(shí)，外植體迅速死亡將影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長(zhǎng)；而潮霉素濃度 8 mg/L 處理既能有效抑制非轉(zhuǎn)化組織的生長(zhǎng)，又不至于造成細(xì)胞迅速死亡，所以潮霉素濃度 8 mg/L是莖尖轉(zhuǎn)化外植體篩選的適宜濃度。

2.2 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

將虎杖莖尖分別預(yù)培養(yǎng) 1、2、4 和 8 d，侵染菌液濃度OD600值約 0.4，侵染莖尖 10 min，共培養(yǎng) 3 d，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)見(jiàn)表2。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)念A(yù)培養(yǎng)可以提高莖尖的再生分化率。預(yù)培養(yǎng) 1 d 時(shí)的再生分化率較低（2.3%），再生芽生長(zhǎng)細(xì)弱，不利于潮霉素抗性苗的獲得；預(yù)培養(yǎng) 2 d 的莖尖再生分化率最高（4.7 %），再生芽生長(zhǎng)健壯；預(yù)培養(yǎng) 8 d 時(shí)的再生分化率反而下降（2.4 %）。所以選擇 2 d 作為預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間。

2.3 菌液濃度對(duì)虎杖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

將農(nóng)桿菌的濃度OD600稀釋為 0.2、0.4、0.6 和0.8，侵染預(yù)培養(yǎng) 2 d 的莖尖 10 min，共培養(yǎng) 3 d，以轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（表3）。本研究中不同的菌液侵染濃度對(duì)侵染效果的影響顯著。菌液侵染濃度OD600在 0.2 時(shí)分化率只有2.4 %，濃度為 0.6 時(shí)的分化率達(dá) 5.5 %，之后隨著濃度的增高分化率降低。故將農(nóng)桿菌菌液濃度稀釋至 0.6 進(jìn)行侵染。

2.4 侵染時(shí)間對(duì)虎杖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

分別侵染預(yù)培養(yǎng) 2 d 的莖尖 5、10、15、20 和25 min，菌液濃度OD600約 0.6，共培養(yǎng)3 d，以轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（表4）。經(jīng) 10 min 侵染后的分化率與其他侵染處理都有顯著差異，侵染5、20 和25 min 之間的差異不顯著。侵染 10 min的再生分化率達(dá)5.3%，增殖系數(shù)較高且再生芽強(qiáng)壯，故將侵染時(shí)間選擇在10 min。

2.5 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)虎杖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

用OD600值約 0.6 的菌液侵染預(yù)培養(yǎng) 2 d 的莖尖10 min，分別于黑暗中共培養(yǎng) 2、3、4 和 5 d，以轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（表5）。不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)侵染結(jié)果的影響差異較大，2 d時(shí)分化率較低（2.4 %），經(jīng)3 d 共培養(yǎng)后分化率可達(dá) 5.6%，但是共培養(yǎng) 5 d 后的分化率又降到2.9 %。本試驗(yàn)條件下選擇在侵染后共培養(yǎng)3 d 較為適宜，有利于獲得較多生長(zhǎng)健壯的抗性再生芽。

2.6 虎杖轉(zhuǎn)化苗的獲得

虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化各階段如圖 2所示。剝離好的莖尖經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后（圖 2-A），進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，并共培養(yǎng)3 d（圖 2-B）；然后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上篩選（圖 2-C），不具潮霉素抗性的莖尖逐漸褐化死亡；將經(jīng)篩選后成活的莖尖轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上（圖2-D），促進(jìn)芽增殖與伸長(zhǎng)；待幼苗生長(zhǎng)至 3-5 cm高，轉(zhuǎn)至根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行生根（圖 2-E）；最后移栽到盆土中生長(zhǎng)（圖 2-F）。

2.7 轉(zhuǎn)基因虎杖的PCR檢測(cè)

按照上述遺傳轉(zhuǎn)化體系，剝?nèi)』⒄惹o尖 300個(gè)，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化、篩選，獲得了移栽成活的抗性植株共 15株，潮霉素基因的PCR檢測(cè)（圖3）顯示其中 6株為轉(zhuǎn)基因的陽(yáng)性植株，這些轉(zhuǎn)基因植株均含有預(yù)期的約 500 bp的DNA片段。

2.8 轉(zhuǎn)基因虎杖的Southern雜交

選取PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因虎杖植株，提取葉片基因組DNA，經(jīng)EcoR I酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜后以潮霉素基因?yàn)殡s交探針的Southern雜交結(jié)果（圖4）表明，在這 6個(gè)株系中均檢測(cè)到雜交條帶，而野生虎杖沒(méi)有雜交信號(hào)。因此，這些轉(zhuǎn)基因虎杖株系的基因組中確實(shí)整合了目的基因。

3 討論

本試驗(yàn)前期采用葉盤(pán)法和愈傷組織侵染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化遇到諸多困難：葉盤(pán)經(jīng)過(guò)不同激素組合誘導(dǎo)，較難誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽；虎杖是含酚類(lèi)物質(zhì)較高的藥用植物，其愈傷組織易褐化、難分化成苗。而植物莖尖具有變異性小、有利于保持原有材料的優(yōu)良性狀等特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者利用莖尖或莖尖分生組織獲得了轉(zhuǎn)基因植株［9-13］。因此，本試驗(yàn)選擇莖尖為轉(zhuǎn)化受體，探討了影響虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素。

潮霉素的毒性機(jī)理是干擾植物細(xì)胞葉綠體和線(xiàn)粒體中的核糖體與延長(zhǎng)因子EF-2 的結(jié)合，從而抑制肽鏈的延長(zhǎng)。潮霉素濃度過(guò)低易造成假陽(yáng)性率過(guò)高；潮霉素濃度過(guò)高，可能導(dǎo)致不能得到足量的轉(zhuǎn)基因植株。在對(duì)植物材料進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化之前，對(duì)受體材料進(jìn)行潮霉素敏感性試驗(yàn)是十分必要的。段曉昱等［15］的研究表明向日葵莖尖、子葉、胚軸不同部位轉(zhuǎn)化外植體對(duì)潮霉素敏感性存在一定的差異；大豆品種黑農(nóng) 35的子葉節(jié)分化的潮霉素篩選濃度為 6 mg/L，而叢生芽生根的潮霉素篩選濃度降低為2 mg/L［16］；可見(jiàn)對(duì)于同一種植物，不同的外植體對(duì)抗生素的敏感性也是不同的。本研究通過(guò)虎杖莖尖對(duì)潮霉素的敏感性試驗(yàn)，確定了虎杖莖尖轉(zhuǎn)化的適宜濃度為 8 mg/L。在連續(xù)篩選過(guò)程中一直使用同一濃度進(jìn)行篩選，這可能是造成轉(zhuǎn)化率低的原因之一。在后續(xù)的研究中可以考察虎杖不同部位外植體對(duì)潮霉素的敏感性，采用梯度添加篩選劑的方式來(lái)提高轉(zhuǎn)化率。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化中，預(yù)培養(yǎng)可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源DNA，從而提高轉(zhuǎn)化率；另一方面預(yù)培養(yǎng)能減少褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生［17］。趙福永［18］對(duì)含酚類(lèi)物質(zhì)較高的棉花進(jìn)行了預(yù)培養(yǎng)處理，根誘導(dǎo)階段根誘導(dǎo)率要比對(duì)照組高 15%左右?；⒄纫彩呛宇?lèi)物質(zhì)較高的植物，本試驗(yàn)中預(yù)培養(yǎng)2 d 是最佳處理，而預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò) 8 d，轉(zhuǎn)化率顯著下降。轉(zhuǎn)化率隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后下降，在高粱莖尖轉(zhuǎn)化中也有類(lèi)似報(bào)道，其原因可能是預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短莖尖傷口未愈合易受農(nóng)桿菌的侵害；預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)莖尖傷口細(xì)胞已不能提供足夠的誘導(dǎo)農(nóng)桿菌貼壁的受體，或由于莖尖分生組織細(xì)胞的分裂速度減緩，進(jìn)入細(xì)胞核的T-DNA 量減少［13］。王沛雅等［19］對(duì)河北楊的遺傳轉(zhuǎn)化研究表明，預(yù)培養(yǎng)2 d以上可以顯著提高轉(zhuǎn)化率，但預(yù)培養(yǎng) 2-8 d 間的差異不顯著，轉(zhuǎn)化率并不表現(xiàn)出隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響可能與所選用植物材料等有關(guān)系。

本試驗(yàn)成功建立了虎杖莖尖為轉(zhuǎn)化受體、以潮霉素為篩選劑的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但虎杖莖尖的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)低于棉花［20］、小麥［9］等作物的莖尖轉(zhuǎn)化效率，所以該遺傳轉(zhuǎn)化體系還有待優(yōu)化。后續(xù)工作可以從農(nóng)桿菌菌株、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法結(jié)合漩渦振蕩、真空負(fù)壓處理等方面來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化該轉(zhuǎn)化體系。

本試驗(yàn)希望通過(guò)提高關(guān)鍵酶基因PcRS在虎杖中的表達(dá)水平，調(diào)控虎杖中白藜蘆醇的生物合成。PCR和Southern雜交檢測(cè)，表明外源基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。但是本試驗(yàn)只進(jìn)行EcoRI 酶的單酶切，還不能準(zhǔn)確確認(rèn)外源基因插入的拷貝數(shù)和位點(diǎn)。在后續(xù)Southern雜交試驗(yàn)中可以采用多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行單酶切，或者采用雙酶切。另外轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性、外源基因的表達(dá)、活性成分的含量變化等方面還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

采用根癌農(nóng)桿菌EHA105 菌株侵染虎杖莖尖較適宜的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為：預(yù)培養(yǎng) 2 d，農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0.6，侵染10 min，共培養(yǎng) 3 d，在篩選培養(yǎng)基中添加 8 mg/L潮霉素，待篩選獲得的抗性芽生長(zhǎng)至 3-5 cm高，再轉(zhuǎn)至根誘導(dǎo)培養(yǎng)基使其長(zhǎng)成完整植株。利用該體系成功實(shí)現(xiàn)虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化白藜蘆醇合酶基因，本研究結(jié)果為拓寬虎杖遺傳轉(zhuǎn)化受體提供了技術(shù)和方法。

［1］ Athar M, Back JH, Tang X, et al. Resveratrol：a review of preclinical studies for human cancer protection［J］. Toxicol Appl Pharmacol,2007, 224（3）：274-283 .

［2］ Anekonda TS. Resveratrol-a boon for treating Alzheimer’s disease?［J］. Brain Res Rev, 2006, 52（2）：316-326.

［3］ Saiko P, Szakmary A, Jaeger W, et al. Resveratrol and its analogs：defense against cancer, coronary disease and neurodegenerative maladies or just a fad?［J］. Mutat Res, 2008, 658（1-2）：68-94.

［4］ 郝大程, 馬培, 穆軍, 等. 中藥植物虎杖根的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組特性分析［J］. 中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué), 2012, 42（5）：398-412.

［5］ Delaunois B, Cordelier S, Conreux A, et al. Molecular engineering of resveratrol in plants［J］. Plant Biotechnol J, 2009, 7（1）：2-12.

［6］ 于樹(shù)宏, 張嫡群, 楊雙革, 等. TDZ和CPPU在虎杖組織培養(yǎng)中的應(yīng)用［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2006, 12（1）：13-17.

［7］ 于樹(shù)宏, 趙麗麗, 王偉, 等. 影響虎杖毛狀根高頻誘導(dǎo)的因素探討［J］. 西北植物學(xué)報(bào), 2005, 25（9）：1740-1746.

［8］ 苗曉燕, 于樹(shù)宏, 沈銀柱, 等. 利用基因轉(zhuǎn)化提高虎杖毛狀根中活性成分的含量［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 42（9）：995-999.

［9］ 楊波, 丁莉萍, 姚璐, 等. 苗齡和農(nóng)桿菌侵染時(shí)間對(duì)小麥莖尖轉(zhuǎn)化效率的影響［J］. 分子植物育種, 2008, 6（2）：358-362 .

［10］ Zapata C, Park SH, Elzik KM, et al. Transformation of a Texas cotton cultivar by using Agrobacterium and the shoot apex［J］. Theor Appl Genet, 1999, 98（2）：252-256.

［11］ 孫傳波, 曲文利, 姜志磊, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)向玉米莖尖導(dǎo)入HAL1基因的初步研究［J］. 玉米科學(xué), 2009, 17（6）：32-34.

［12］ 王貴榮, 劉敬梅, 高山林. 煙草Ⅰ類(lèi)幾丁質(zhì)酶和β-1, 3 葡聚糖酶基因莖尖轉(zhuǎn)化太子參的研究［J］. 藥物生物技術(shù), 2006, 13（5）：334-337.

［13］ 張明洲, 崔海瑞, 舒慶堯, 等. 高粱莖尖再生體系及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因子的研究［J］. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2006, 20（1）：23-26.

［14］ 柳忠玉, 莊楚雄, 生書(shū)晶, 等. 虎杖白藜蘆醇合酶基因轉(zhuǎn)化擬南芥的研究［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 39（5）：138-142.

［15］ 段曉昱, 欒春光, 郝彥玲, 等. 向日葵遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素適宜篩選濃度的研究［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 39（3）：239-244.

［16］ 鄒莉, 文藝, 張勻華, 等. 大豆子葉節(jié)對(duì)潮霉素敏感性研究［J］.大豆科學(xué), 2008, 27（2）：267-269.

［17］ 王關(guān)林, 方宏筠. 植物基因工程原理與技術(shù)［M］. 北京：科學(xué)出版社, 1998.

［18］ 趙福永. 棉花莖尖農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37（2）：515-518.

［19］ 王沛雅, 楊暉, 楊濤, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的河北楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2012（3）：141-147.

［20］ 雷江榮, 王冬, 梅邵林, 等. 農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化莖尖獲得轉(zhuǎn)SNC1基因棉花及其T1植株對(duì)棉花枯萎病的抗性［J］.分子植物育種, 2010, 8（2）：252-258.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of Shoot Tip of Polygonum cuspidatum

Liu Zhongyu1Zhao Shujin2
（1. College of Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025；2. General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010）

In order to establish Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation system of Polygonum cuspidatum shoot tip, some key factors that affect transformation frequency of P. cuspidatum shoot tip were studied. The shoot tips of P. cuspidatum was infected by Agrobacterium tumefaciens EHA105 with the plasmid which contains PcRS gene. The superior transformation system was as following, precultured 2 days and then infected 10 minutes in suspension（OD600=0.6）, co-cultured 3 days, transgenic tissues and shoots were selected with 8 mg/L hygromycin. Six transgenic plants from 300 explants were obtained and the intergration of transgene was confirmed by PCR and Southern blot analysis.

Polygonum cuspidatum Shoot tip Agrobacterium tumefaciens Genetic transformation

2013-08-19

廣東省自然科學(xué)基金（10151001002000012），長(zhǎng)江大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（801100010122）

柳忠玉，女，博士，講師，研究方向：中藥生物技術(shù)；E-mail：zyliu2004@126.com

趙樹(shù)進(jìn)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物制藥；E-mail：gzzsjzhs@163.com