周群 盛莉

（上海理工大學(xué) 實驗室管理與服務(wù)中心，上海 200093）

pH對米根霉發(fā)酵廚余垃圾生產(chǎn)L-乳酸的影響

周群 盛莉

（上海理工大學(xué) 實驗室管理與服務(wù)中心，上海 200093）

為了強化廚余垃圾發(fā)酵L-乳酸的產(chǎn)量和光學(xué)純度，研究了pH對米根霉AS3.819發(fā)酵廚余垃圾生產(chǎn)乳酸及其光學(xué)特性的影響。結(jié)果表明，在中溫條件下（34℃），米根霉生長的最適pH為7，最適發(fā)酵條件為8。用米根霉發(fā)酵非滅菌的廚余垃圾生產(chǎn)乳酸，發(fā)酵液中還原糖濃度低，且呈先升高，后下降到最低的趨勢。pH 調(diào)節(jié)到近中性和偏堿性（pH6、7、8）的各組還原糖濃度高于偏酸性組（pH 5和對照組）。控制pH為8時，總?cè)樗岙a(chǎn)生速率達1 g/（L·h），L-乳酸是主要的異構(gòu)體形式，L-乳酸在總?cè)樗嶂械谋壤谡麄€發(fā)酵時間段內(nèi)都保持在0.75以上，L-乳酸濃度最高達到59.8 g/L，L-乳酸光學(xué)純度可達到0.99?？刂苝H為8時，可以同時獲得高的乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度。

廚余垃圾 米根霉AS3.819 還原糖 L-乳酸 光學(xué)純度

廚余垃圾是居民在生活消費過程中形成的一種生活廢物，僅上海市每天的產(chǎn)生量就達1 300余 t。廚房垃圾主要包括米和面粉類食物殘余、蔬菜、植物油、動物油、肉骨、魚刺等，從化學(xué)組分來分，有淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、脂類、和無機鹽等。與其它垃圾相比，廚余垃圾含水量高，不適于焚燒處理，且易腐敗發(fā)臭，因此急需處理廚房垃圾的新技術(shù)［1-3］。1999年日本學(xué)者Shirai［4］提出了一種實現(xiàn)廚房垃圾減量化、無害化和資源化的新途徑，即通過發(fā)酵廚房垃圾生產(chǎn)乳酸，進而可以合成聚乳酸這種可生物降解性塑料［5］。不僅可以解決廚余垃圾的資源化問題，還有利于可生物降解塑料早日取代通用塑料，有望解決困擾人類多年的白色污染難題。

乳酸，特別是L-乳酸在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)應(yīng)用廣泛，聚L-乳酸在解決白色污染和醫(yī)用生物材料等方面有巨大需求，因此，L-乳酸未來的需求十分巨大。據(jù)估計，我國未來20年至50年內(nèi)，L-乳酸在傳統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域預(yù)計將達到5-8萬t，聚乳酸的潛在市場將達250萬t以上，與之匹配的L-乳酸的需求量將達到350-400萬t（每生產(chǎn)1 t聚乳酸，需耗用乳酸1.5 t左右）。L-乳酸作為合成聚乳酸的底物，將成為我國又一新的大宗生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)，將是繼我國檸檬酸、味精、飼料賴氨酸后最具規(guī)模化的生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)之一，其前景將比已有的發(fā)酵產(chǎn)業(yè)更為看好［6］。我國經(jīng)過“九五”科技攻關(guān)和“863”計劃的支持，已基本具備了生產(chǎn)聚乳酸產(chǎn)品的技術(shù)，但是由于目前L-乳酸生產(chǎn)成本高、質(zhì)量低，限制了L-乳酸的大規(guī)模生產(chǎn)。為了提高我國L-乳酸產(chǎn)品的國際競爭力和市場占有率，高質(zhì)量、低成本的L-乳酸生產(chǎn)技術(shù)是目前急需解決的重要課題。因此，不斷改進乳酸發(fā)酵工藝技術(shù)勢在必行［7］。

米根霉由于具有發(fā)酵產(chǎn)物L-乳酸光學(xué)純度高、營養(yǎng)需求簡單、生產(chǎn)成本低、菌絲體大、可直接利用淀粉發(fā)酵等優(yōu)點，而成為高光學(xué)純度L-乳酸的主要生產(chǎn)菌種［8］。由于淀粉是廚余垃圾的主要碳源物質(zhì)，因此以解淀粉米根霉AS3.819作為菌種，將有利于廚余垃圾的乳酸發(fā)酵。本試驗研究了pH對米根霉AS3.819發(fā)酵廚余垃圾生產(chǎn)乳酸及其光學(xué)純度的影響，旨在強化廚余垃圾的L-乳酸發(fā)酵，提高L-乳酸光學(xué)純度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 廚余垃圾來源及特性 廚余垃圾來自上海理工大學(xué)第六食堂，主要成分包括米飯、蔬菜、肉類和豆腐，面條等。取來的廚余垃圾先經(jīng)過粉碎機粉碎，再經(jīng)過大孔徑（孔徑0.5 cm）陶瓷過濾器過濾。廚余垃圾的主要性質(zhì)見表1。

1.1.2 菌種培養(yǎng) 米根霉AS3.819，購于中科院微生物所菌種保藏中心。懸液制備［7］：PDA平板培養(yǎng)米根霉至長出孢子，刮取長有孢子的菌絲至裝有無菌水的三角瓶中，加入無菌玻璃珠震蕩，用塞棉花的無菌漏斗過濾，收集濾液，調(diào)整孢子濃度至107/ mL。

1.2 方法

1.2.1 試驗條件和操作 取100 g 粉碎后的垃圾加入150 mL水，裝入500 mL具塞三角瓶中。接種量為10%。用10%的NaOH或2 mol/L的HCL調(diào)節(jié)pH至設(shè)定值（pH為5、6、7、8）；對照反應(yīng)瓶不調(diào)節(jié)pH和不加入緩沖溶液；三角瓶放于振蕩器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)定為34℃，轉(zhuǎn)速設(shè)為100 r/min。每10 h測定培養(yǎng)液pH及取樣測定培養(yǎng)液化學(xué)組成。

1.2.2 分析方法 TS、DS、SS、VS與PH用APHA標準方法檢測［9］。還原糖用3，5-二硝基水楊酸比色法測定［10］。乳酸用裝有手性分離柱Astec CLC（Dikma，USA）的高效液相色譜Agilent 1200測定，流動相為5 mmol/L CuSO4溶液，流量1 mL/min［3］。

1.2.3 置信度 有限次數(shù)測定真值與平均值之間有如下關(guān)系：

其中，s為標準偏差；n為測定次數(shù)；t為選定的某一置信度下的幾率系數(shù)（統(tǒng)計因子）。本試驗的置信度為95%，所有試驗的結(jié)果代表3次試驗的平均值。

2 結(jié)果

2.1 細胞生長最適pH的探究

在不同pH的100 mL種子培養(yǎng)液（培養(yǎng)液成分（g/L）：葡萄糖20，硫酸銨4，磷酸二氫鉀0.3，七水硫酸鋅0.05，硫酸鎂0.3，pH自然。將培養(yǎng)基裝入三角瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min）中，放入10 mL米根霉菌種，培養(yǎng)溫度設(shè)定為34℃，轉(zhuǎn)速設(shè)為100 r/min，培養(yǎng)80 h，觀測其生長曲線，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，米根霉生長最適pH為7，最適生長pH范圍為6-8，pH小于6與高于8，菌體生長就會受到抑制。

2.2 乳酸發(fā)酵最適pH的探究

2.2.1 還原糖 圖2 顯示了不同pH條件下，廚余垃圾發(fā)酵液中還原糖濃度的變化。從圖2可以看出，在各pH條件下，還原糖濃度均表現(xiàn)出先升高到最高然后下降到最低的趨勢，在30-60 h時間段內(nèi)，pH為6、7、8的3組發(fā)酵液中還原糖濃度要明顯高pH為5以及不調(diào)節(jié)pH的組。pH等于8時在整個發(fā)酵時間段內(nèi)發(fā)酵液中還原糖含量最大。

2.2.2 乳酸 圖3顯示了不同pH條件下乳酸濃度的變化，在80 h的發(fā)酵時間內(nèi)，不同pH條件下，乳酸濃度增長趨勢為：在0-10 h內(nèi)緩慢增加，10-60 h內(nèi)快速增加至最高點，60 h后基本維持穩(wěn)定。從圖3中看出，乳酸最高濃度出現(xiàn)在pH8組，最高濃度為60 g/L，60 h內(nèi)乳酸產(chǎn)生速率為1 g/（L·h）。

2.2.3 L-乳酸的光學(xué)特性 如圖4所示，乳酸的兩個光學(xué)異構(gòu)體L-乳酸和D-乳酸，在各pH條件下，發(fā)酵的前期0-60 h時間段內(nèi)，L-乳酸濃度持續(xù)增加，D-乳酸濃度不斷減少。 pH為7，8組，整個發(fā)酵過程中L-乳酸濃度都比較高，D-乳酸濃度在整個發(fā)酵過程中都很低，尤其是越到發(fā)酵后期D-乳酸濃度越低，到發(fā)酵結(jié)束時幾乎為零。pH8時，乳酸光學(xué)純度從最初的0.75達到最終的0.99。

3 討論

pH對于微生物的生命活動影響很大，主要通過幾個方面實現(xiàn)：一是使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶電荷發(fā)生變化，從而影響其生物活性；二是引起細胞膜電荷變化，導(dǎo)致微生物細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力改變；三是改變環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的可給性及有害物質(zhì)的毒性［11］。微生物通?？稍谝粋€較寬pH范圍內(nèi)生長，并且遠離它們的最適pH，但它們對pH變化的耐受性也有一定限度。細胞質(zhì)中pH突然變化會破壞質(zhì)膜、抑制酶活性及影響膜運輸?shù)鞍椎墓δ埽瑥亩鴮ξ⑸镌斐蓳p傷，環(huán)境中pH的變化會改變營養(yǎng)物質(zhì)分子的電離狀態(tài)，降低它們被微生物利用的有效性［12］。每種微生物都有其最適pH和一定的pH范圍，在最適范圍內(nèi)酶活性最高，如果其他條件適合，微生物的生長率也最高。 隨著環(huán)境pH值的不斷變化，使得微生物繼續(xù)生長受阻，當超過最低或最高pH值時微生物就死亡［13］。同一種微生物由于培養(yǎng)液pH值的不同，可能積累不同的代謝產(chǎn)物［14］。米根霉L-乳酸發(fā)酵過程因產(chǎn)生L-乳酸而使pH不斷降低，因此有必要對發(fā)酵過程中的pH進行調(diào)節(jié)。以達到強化廚余垃圾的L-乳酸發(fā)酵，提高L-乳酸光學(xué)純度的目的。

本試驗利用6 mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH，探究了細胞生長最適pH，乳酸發(fā)酵最適pH。細胞生長的最適pH為7，最適生長范圍是6-8，因此選擇細胞發(fā)酵的pH范圍為5，6，7，8。鑒于pH為9時菌體生長嚴重受阻，且需要利用大量NaOH來調(diào)節(jié)，所以發(fā)酵試驗沒有選擇pH為9的條件進行試驗。

pH為6，7，8各組還原糖濃度高于pH為5組和對照組，這是由于pH偏中性和堿性有利于微生物的合成代謝，有利于碳水化合物的水解過程［15，16］。

pH調(diào)節(jié)為堿性組乳酸濃度明顯高于pH中性、酸性與對照組。表明在中溫條件下，控制pH為堿性有利于米根霉發(fā)酵廚房垃圾乳酸的生成。在30-60 h內(nèi)，pH為6，7，8各組較高的還原糖產(chǎn)生量保證了乳酸較高的產(chǎn)生速率。

乳酸脫氫酶具有立體異構(gòu)性，有L-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶，因此乳酸具有L-乳酸和D-乳酸兩個光學(xué)異構(gòu)體［17］。在以米根霉AS3.819為主導(dǎo)菌種的非滅菌發(fā)酵系統(tǒng)中，還包含著其他多種微生物種群，這種微生物種群結(jié)構(gòu)以及環(huán)境條件會影響L-乳酸的光學(xué)純度。試驗表明pH為7，8時，整個發(fā)酵過程中L-乳酸濃度都比較高，D-乳酸濃度在整個發(fā)酵過程中都很低，尤其是越到發(fā)酵后期D-乳酸濃度越低，到發(fā)酵結(jié)束時幾乎為零。這表明堿性條件發(fā)酵會提高L-乳酸的光學(xué)純度?，F(xiàn)行的工業(yè)生產(chǎn)上，應(yīng)用最廣的是乳酸菌，這是因為它生長速度快，產(chǎn)酸率高，耐酸性強而且厭氧發(fā)酵可大規(guī)模降低能耗等優(yōu)點［18］。但在乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸時，經(jīng)?；烊霂в邢傅钠渌?，使產(chǎn)生的L-乳酸消旋化，難以制得高純度的L-乳酸［8］。本試驗利用不滅菌的廚余垃圾發(fā)酵，接種米根霉AS3.819，在中溫條件下選擇最優(yōu)pH進行發(fā)酵，強化了廚余垃圾的L-乳酸發(fā)酵。發(fā)酵過程中不僅省略了滅菌過程，簡化了生產(chǎn)工藝，而且在實際生產(chǎn)中節(jié)約了大量的冷卻水。本試驗表明，pH控制為8可同時獲得較高的L-乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度，這對廚余垃圾的工藝優(yōu)化具有重要參考價值。

4 結(jié)論

米根霉菌體在不同pH的種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)，米根霉生長最適pH為7，最適生長pH范圍為6-8。

采用接種米根霉AS3.819的非滅菌廚余垃圾發(fā)酵產(chǎn)乳酸，發(fā)酵液中還原糖濃度低且均呈先升高，后下降到最低的趨勢。pH為8時總?cè)樗岙a(chǎn)量最大，最高濃度為60 g/L，60 h內(nèi)乳酸產(chǎn)生速率為1 g/L。

控制pH為堿性時，L-乳酸是主要的異構(gòu)體形式，并且越到發(fā)酵后期光學(xué)純度越高?？刂苝H為8時，L-乳酸光學(xué)純度可達到0.99。

在中溫條件下，為同時獲得高的乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度，最優(yōu)的pH應(yīng)調(diào)節(jié)為8。

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（責任編輯 李楠）

Effect of pH on Yield of Lactic Acid from Kitchen Wastes Fermentation by Rhizopus Oryzae AS 3.819

Zhou Qun Sheng Li
（Collge of Science，University of Shanghai for Science & Technology，Shanghai 200093）

In order to realize resource recycling of kitchen waste, the enhancement of fermentative production of lactic acid（LA）byRhizopus oryzaeAS 3.819 was investigated. Batch experiments were carried out to analyze the effect of pH on the yield of total lactic acid and the distribution of L- and D-lactic acid among total lactic acid during the non-sterilized fermentation of kitchen wastes byrhizopus oryzaeAS 3.819. The results showed that whenrhizopus oryzaewas cultured in medium temperature（34℃）, the optimal growth condition was pH 7, the optimal fermentation condition was pH8. The concentration of reduced sugar（calculated as glucose）was low, and its concentration was higher at neutral and alkali conditions（pH6-8）than at acidic conditions（non-controlled pH and pH5）. The L-lactic acid was the predominant isomer form at pH 8. The maximum total lactic acid production rate was 1g/（L·h）, the ratio of L-lactic acid kept at above 0.75 during the whole experimental fermentation time and reached the maximum value（0.99）at 60 h and the maximum L-lactic acid was 59.8 g/L. To obtain high L-lactic acid yield and optical purity simultaneously, it was suggested that PH should be controlled at 8.

Kitchen refuseRhizopus oryzaeAS 3.819 Reduced sugar L- lactic acid Optical purity

2013-09-17

周群，女，教師，研究方向：生物仿生學(xué)；E-mail：pingguotubao@aliyun.com

盛莉，女，碩士研究生，研究方向：光學(xué)；E-mail：shenglizaiwang1233@163.com