潘曉菲時(shí)麗麗譚初兵呂超君徐為人湯立達(dá)

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070；2.天津藥物研究院 天津市新藥設(shè)計(jì)與發(fā)現(xiàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

人內(nèi)皮素受體A基因克隆及表達(dá)

潘曉菲1時(shí)麗麗2譚初兵2呂超君1徐為人2湯立達(dá)2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070；2.天津藥物研究院 天津市新藥設(shè)計(jì)與發(fā)現(xiàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

為了建立內(nèi)皮素受體拮抗劑篩選系統(tǒng)，克隆人ETA基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)pTag-Lite SNAP-ETA在CHOK1細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)。從人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中克隆人ETA基因，連接到pTag-Lite SNAP質(zhì)粒，構(gòu)建表達(dá)載體pTag-Lite SNAPETA，用FuGENERHD轉(zhuǎn)染試劑將表達(dá)載體pTag-Lite SNAP-ETA轉(zhuǎn)染入CHO-K1細(xì)胞內(nèi)，通過熒光顯微鏡檢測融合蛋白SNAP-ETA的表達(dá)。DNA測序結(jié)果表明pTag-Lite SNAP-ETA表達(dá)載體構(gòu)建成功，熒光顯微鏡檢測結(jié)果表明人ETA在CHO-K1細(xì)胞中有效表達(dá)。

內(nèi)皮素受體A RT-PCR pTag-Lite SNAP載體 CHO-K1細(xì)胞 表達(dá)

內(nèi)皮素（Endothelin，ET）是一種含有21個(gè)氨基酸的多肽，是目前已知的作用最強(qiáng)和效應(yīng)最持久的血管活性肽，有強(qiáng)烈的血管收縮和促平滑肌細(xì)胞遷移、增殖作用，廣泛作用于體內(nèi)多系統(tǒng)，有ET-1、ET-2、ET-3三種亞型，與高血壓、充血性心力衰竭、糖尿病、癌癥及纖維化等有著密切聯(lián)系。內(nèi)皮素主要通過與靶細(xì)胞膜上的內(nèi)皮素受體（Endothelin receptor，ETR）結(jié)合后發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，并在心血管疾病、腎臟疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和腫瘤等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色，因此拮抗ET與ETR的相互作用被認(rèn)為是治療此類疾病的有效治療途徑，而抑制ETR是阻斷ET生理病理學(xué)效應(yīng)的主要手段［1-9］。人的ETR分為ETA和ETB兩亞型，均為G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR），但兩者功能存在差異。ETA被認(rèn)為是基本的縮血管和促生長受體，ETB在血管系統(tǒng)中抑制細(xì)胞生長和血管收縮，因其參與ET-1的清除被稱為“清除受體”。內(nèi)皮素及其受體多樣性地廣泛分布于各組織，通過不同的亞型和信號(hào)傳遞系統(tǒng)介導(dǎo)復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，與多種心血管系統(tǒng)疾病和糖尿病等有密切聯(lián)系［10-13］，其中ETA發(fā)揮的作用為主要［14，15］。本研究從人肺腺癌細(xì)胞A549中克隆了人ETA基因，將其導(dǎo)入pTag-Lite SNAP質(zhì)粒中，獲得重組pTag-Lite SNAP-ETA載體，再將其轉(zhuǎn)染至CHO-K1細(xì)胞內(nèi)，使SNAP-ETA融合蛋白得以表達(dá)，為后期ETA的體外研究以及拮抗劑的篩選、活性評(píng)價(jià)等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1場購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，細(xì)胞在37℃、5% CO2、飽和濕度下用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；pTag-Lite SNAP質(zhì)粒（Tag-liteTMSNAP-plasmid）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心饋贈(zèng)。

1.1.2 試劑 限制性核酸內(nèi)切酶、primerSTARHSDNA聚合酶、T4DNA連接酶和DNA Marker均購自大連寶生物公司（日本TaKaRa公司）；PCR純化試劑盒和凝膠回收試劑盒購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司；PrimeScript 1ststrand cDNA synthesis Kit、大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；引物由華大基因科技服務(wù)有限公司合成；Trizol，胰蛋白酶購自天津市聯(lián)星生物技術(shù)有限公司；FuGENE? HD Transfection Reagent購自美國Promega公司；SNAPCell Fluorescein購于美國NEB公司；其他均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購自美國Oxoid公司，固體培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂；細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 Trizol法提取總RNA 選取生長態(tài)勢良好的A549細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA，將提取總RNA加入紫外板，稀釋后酶標(biāo)儀測定OD260/ OD280，確定總RNA的純度及濃度。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增ETAcDNA 以上述提取的細(xì)胞總RNA為模板，按照PrimeScript 1ststrand cDNA synthesis Kit使用說明書進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件為37℃，60 min；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果，置-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 擴(kuò)增ETA基因 根據(jù)GenBank公布的人ETA（NM_001957.3）基因序列，使用Oligo軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增ETA的引物（表1）。以前期獲得的cDNA為模板，分別擴(kuò)增ETA基因片段，反應(yīng)條件為98℃，2 min；98℃，10 s；68℃，80 s；30個(gè)循環(huán)后72℃，10 min；4℃儲(chǔ)存，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 構(gòu)建pTag-Lite SNAP-ETA表達(dá)載體 對(duì)提取的pTag-Lite SNAP質(zhì)粒和回收的ETA基因片段，進(jìn)行ApaI和XhoI雙酶切；切膠回收酶切產(chǎn)物，按載體與片段1：5的摩爾濃度，T4連接酶22℃連接2 h；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliTOP10，利用氨芐霉素進(jìn)行抗生素篩選轉(zhuǎn)化子；通過ApaI和XhoI雙酶切及菌落PCR鑒定質(zhì)粒，挑取陽性質(zhì)粒送測序，獲取重組表達(dá)載體SANP-ETA，構(gòu)建流程如圖1所示。

1.2.5 定點(diǎn)突變ETA基因 經(jīng)數(shù)次基因測序鑒定，從A549細(xì)胞系獲得的ETA基因在第343（G-A）、964（C-A）、1 225（A-G）位點(diǎn)有3處突變，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物（表1）。定點(diǎn)突變PCR條件：94℃，3 min；98℃，10 s；50℃，5 s；72℃，8 min；30個(gè)循環(huán)后72℃，10 min；4℃儲(chǔ)存。T4連接酶連接純化后的PCR產(chǎn)物，DpnI酶切去除模板質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入E. coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有氨芐篩選抗性的固體培養(yǎng)板上，選取幾株搖菌送測序（由北京六合華大基因科技股份有限公司測序鑒定），依次將3個(gè)位點(diǎn)全部突變回正常的基因序列。

1.2.6 提取pTag-Lite SNAP-ETA無內(nèi)毒素質(zhì)粒 分別接種TOP10：pTag-Lite SANP-ETA菌株，37℃，200 r/min，過夜培養(yǎng)；收集菌體，按照天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒使用說明書操作，提取pTag-Lite SNAP-ETA無內(nèi)毒素質(zhì)粒。將提取質(zhì)粒加入紫外板，酶標(biāo)儀測定OD260/ OD280，確定質(zhì)粒純度與濃度。

1.2.7 轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞 培養(yǎng)生長態(tài)勢良好的CHO-K1細(xì)胞，待其融合度為80%-90%時(shí)用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按每孔4×104細(xì)胞密度接種于96孔板內(nèi)；待細(xì)胞生長至融合度80%-90%時(shí)，依據(jù)FuGENE? HD說明書進(jìn)行操作，將pTag-Lite SNAPETA質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CHO-K1細(xì)胞內(nèi)，37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.8 熒光顯微鏡檢測SNAP-ETA融合蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后，棄原培養(yǎng)基，用含5 μmol/L SNAP-tag底物的細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)30 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞3次，再用無血清培養(yǎng)基孵育30 min，棄掉培養(yǎng)基，在倒置熒光顯微鏡下拍照，激發(fā)波長為500 nm，發(fā)射波長為532 nm。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取

從人肺癌細(xì)胞A549中提取總RNA，測定的OD260/OD280值位于1.8-2.0之間，說明所提取的RNA純度較高，無DNA和蛋白污染。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證（圖2），顯示提取的總RNA無雜帶，未見明顯降解，也無DNA污染，總RNA完整性較好。

2.2 人ETA基因的克隆

GenBank公布的人ETA（NM_001957.3）基因序列大小分別為1 284 bp。以上述提取的A549總RNA為模板，通過RT-PCR獲得ETA基因PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示克隆到了約1 300 bp大小的條帶（圖3），與目的條帶大小基本一致。

2.3 pTag-Lite SNAP-ETA質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

利用ApaI和XhoI雙酶切位點(diǎn)將ETA基因片段連接入pTag-Lite SNAP質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化入E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，搖菌并接種于含氨芐霉素抗性篩選基因的平板上，過夜進(jìn)行菌落PCR鑒定，并對(duì)菌落PCR陽性結(jié)果提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖4），將陽性克隆子送測序。經(jīng)過數(shù)次測序結(jié)果顯示pTag-Lite SNAP-ETA載體出現(xiàn)3處突變（圖5-A），分別位于343（G-A），964（C-A）和1225（A-G）位，并影響其編碼的氨基酸序列。利用定點(diǎn)突變?cè)硪来螌?duì)ETA進(jìn)行定點(diǎn)突變，最后測序結(jié)果（圖5-B）顯示突變成功，pTag-Lite SNAP-ETA載體序列與目的序列一致。

2.4 熒光顯微鏡檢測SNAP-ETA融合蛋白的表達(dá)

將CHO-K1細(xì)胞接種入黑色96孔板內(nèi)，用FuGENE轉(zhuǎn)染pTag-Lite SNAP-ETA表達(dá)載體，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，轉(zhuǎn)染24 h后用SNAP-tag底物孵育CHO-K1細(xì)胞，經(jīng)SNAP-tag底物處理的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果顯示，沒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞未見紅色熒光（圖6 -C），而轉(zhuǎn)染pTag-Lite SNAPETRA（圖6-D）的細(xì)胞可見紅色熒光，證明SNAPETA融合蛋白在CHO-K1細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)；與普通顯微鏡照片（圖6-B）相比，SNAP-ETA融合蛋白表達(dá)量較大。

3 討論

ETR廣泛表達(dá)于人體的各組織器官，不僅存在于血管和支氣管平滑肌，在心肌、肺臟、腎臟、腎上腺、腦、眼、腸等組織中也有不同亞型和不同密度的ETR分布。ETR與心血管疾病、腎臟疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和癌癥等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系［12，16］。目前，阻斷ETR（主要針對(duì)ETA）被認(rèn)為是治療高血壓，尤其是肺動(dòng)脈高壓（Pulmonary artery hypertension，PAH）較有效的手段。內(nèi)皮素受體拮抗劑分為肽類和非肽類兩種類型：肽類ETR拮抗劑對(duì)ETA、ETB無選擇性，半衰期短、生物利用度低，口服吸收不良，臨床應(yīng)用的療效不理想。非肽類ETR拮抗劑半衰期較長，口服吸收良好，目前成為主要研發(fā)的方向。目前已經(jīng)上市的內(nèi)皮素受體拮抗劑有波生坦、西他生坦和安倍生坦，均為治療肺動(dòng)脈高壓的藥物［17］。馬西替坦在肺動(dòng)脈高壓治療中表現(xiàn)出良好臨床療效以及良好的耐受性［18，19］，其開發(fā)已進(jìn)入注冊(cè)階段。然而波生坦因用藥量大、藥物相互作用多以及肝臟毒性等缺點(diǎn)，其應(yīng)用受到限制［17］，西他生坦更是因其致死性肝臟損傷于2010年撤市?，F(xiàn)有的藥物對(duì)肺動(dòng)脈高壓以及其他相關(guān)疾病的治療遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還需要尋找更多安全有效的藥物。解決此問題，建立快捷方便的篩選方法是加快尋找ETR拮抗劑比較有效的途徑。

為建立ETA特異的拮抗劑篩選系統(tǒng)，本研究成功地從A549細(xì)胞RNA中克隆了人ETA基因，并采用了真核表達(dá)載體pTag-lite SNAP作為載體質(zhì)粒，融合表達(dá)了SNAP-ETA蛋白。Tag-lite是SNAP-Tag與HTRF技術(shù)相結(jié)合用來進(jìn)行細(xì)胞表面受體分析的一種技術(shù)［20］。SNAP是小的融合標(biāo)簽蛋白，可以非常容易地融合到目標(biāo)蛋白的N端，又可特異性地與底物通過芐甲基不可逆共價(jià)結(jié)合，底物可與各種染料形成衍生物，這樣就可以通過對(duì)底物進(jìn)行熒光標(biāo)記進(jìn)而定位目標(biāo)蛋白。另外，當(dāng)?shù)孜锱cHTRF熒光染料反應(yīng)形成衍生物，SNAP-ETA融合蛋白通過與底物特異結(jié)合被標(biāo)記，這時(shí)加入受體熒光染料標(biāo)記的配體，就可以根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行受體配體結(jié)合、ETA異源二聚化試驗(yàn)、寡聚化試驗(yàn)以及內(nèi)源化試驗(yàn)等細(xì)胞表面受體分析［20］。以此原理建立的ETA拮抗劑篩選模型信噪比強(qiáng)，靈敏度高，并可實(shí)現(xiàn)高通量篩選。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了pTag-Lite SNAP-ETA真核表達(dá)載體，并完成在CHO-K1細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)，為ETA的體外研究及其拮抗劑篩選、活性評(píng)價(jià)等與之相關(guān)研究提供了新的方法。

［1］ Kappers MH, Van esch JH, Sluiter W, et al. Hypertension induced by the tyrosine kinase inhibitor sunitinib is associated with increased circulating Endothelin-1 levels［J］. Hypertension, 2010, 56（4）：675-681.

［2］ Widyantoro B, Emoto N, Nakayama K, et al. Endothelial cellderived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition［J］. Circulation, 2010, 121（22）：2407-2418.

［3］ Eric TW. Endothelium-derived endothelin-1［J/OL］. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology, 2010, 459（6）：951-958.

［4］ Reriani M, Raichlin E, Prasad A, et al. Long-Term administration of endothelin receptor antagonist improves coronary endothelial function in patients with early atherosclerosis［J］. Circulation, 2010, 122（10）：958-966.

［5］ Kohan D. Endothelin, hypertension, and chronic kidney disease：new insights［J］. Current Opinion in Nephrology and Hypertension, 2010, 19（2）：134-139.

［6］ Dhaun N, Macintyre IM, Melville V, et al. Blood pressure independent reduction in proteinuria and arterial stiffness after acute endothelin-A receptor antagonism in chronic kidney disease［J］. Hypertension, 2009, 54（1）：113-119.

［7］ Bagnato ARosano L. The endothelin axis in cancer［J/OL］. Int J Biochem Cell Biol, 2008, 40（8）：1443-1451.

［8］ Bagnato A, Loizidou M, Pflug B R, et al. Role of the endothelin axis and its antagonists in the treatment of cancer［J］. British Journal of Pharmacology, 2011, 163（2）：220-233.

［9］ Ergul A. Endothelin-1 and diabetic complications：Focus on the vasculature［J］. Pharmacological Research, 2011, 63（6）：477-482.

［10］ Bouallegue A, Daou GB, Srivastava AK. Endothelin-1-induced signaling pathways in vascular smooth muscle cells［J］. Current Vascular Pharmacology, 2007, 5（1）：45-52.

［11］ Masaki T. Historical review：Endothelin［J］. TRENDS in Pharmacological Sciences, 2004, 25（4）：221-224.

［12］ Yanagisawa M, Masashi B. Endothelin 20 years from discovery to therapy［J］. Can J Physiol Pharmacol, 2008, 86（8）：485-498.

［13］ Watts SW. Endothelin receptors：what's new and what do we need to know?［J］. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 2010, 298（2）：R254-R260.

［14］ Schneider MP, Boesen EI, Pollock DM. Contrasting actions of endothelin ETA and ETB receptors in cardiovascular disease［J］. Annu Rev Pharmacool Toxicol, 2007, 47（0）：731-759.

［15］ Maclean MR, Mcculloch KM, Baird M. Endothelin ETA-and ETB-receptor-mediated vasoconstriction in rat pulmonary arteries and arterioles［J］. J Cardiovasc Pharmacol, 1994, 23（5）：838-845.

［16］ 張希洲.內(nèi)皮素受體研究新進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)：創(chuàng)傷與外科基本問題分冊(cè), 1998, 19（4）：193-199.

［17］ Atsushi Y. Recent advances and future perspectives in therapeutic strategies for pulmonary［J］. Journal of Cardiology, 2012, 60（5）：344-349.

［18］ Lewis R, Tomas P, Richard C, et al. Effect of macitentan on morbidity and mortality in pulmonary arterial hypertension（pah）：results from the seraphin trial［J］. CHEST Journal, 2012, 142（4）：1026A.

［19］ Patricia NS, Giersbergen PV, Halabi A, et al. Macitentan entryinto-humans study with a new endothelin［J］. European Journal of Clinical Pharmacology, 2011, 67（10）：977-984.

［20］ Maurel D, Comps-agrar L, Brock C, et al. Cell-surface proteinprotein interaction analysis with time-resolved FRET and snaptag technologies：application to GPCR oligomerization［J］. Nat Methods, 2008, 5（6）：561-567.

（責(zé)任編輯 李楠）

Clone and Expression of Human ETA

Pan Xiaofei1Shi Lili2Tan Chubing2Lü Chaojun1Xu Weiren2Tang Lida2
（1. Basic Medical College，Tianjin Medical University，Tianjin 300070；2. Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery，Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300193）

It was to facilitate inhibitor screening of endothelin receptor, cloning of human endothelin receptor geneETA, construction of eukaryotic expression vectors and transient expression of pTag-Lite SNAP-ETAin CHO-K1 cells. Method HumanETAgene fragment were amplified from human lung cancer cell line A549 via RT-PCR and inserted into pTag-Lite SNAP plasmid, the recombinant plasmids were then transiently transfected into CHO-K1 cells using FuGENE? HD, expression ofETAwas observed via fluorescence microscope. Result Sequencing result showed pTag-Lite SNAP-ETAexpression vector were correctly constructed. Fluorescence microscope images indicated that two vectors were expressed in CHO-K1 cells.

human endothelin receptor gene RT-PCR pTag-Lite SNAP CHO-K1 cell expression

2013-08-12

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃（12JCYBJC18800），國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2012ZX09105102，2011ZX-09401-009）

潘曉菲，女，碩士研究生，研究方向：藥理學(xué)；E-mail：sumu7@126.com

時(shí)麗麗，女，助理研究員，博士，研究方向：藥理學(xué)及新藥發(fā)現(xiàn)，E-mail：shill@tjipr.com；湯立達(dá)，男，研究員，博士生導(dǎo)師，博士，研究方向：心血管藥理學(xué)及藥物創(chuàng)新設(shè)計(jì)，E-mail：tangld@tjipr.com