李軍 高廣春 李白 朱志明

（1. 嘉興市農(nóng)業(yè)科學研究院，嘉興 314016；2. 嘉興學院 醫(yī)學院，嘉興 314001；3. 嘉興市天禾藏紅花專業(yè)合作社，嘉興 314000）

植物病毒廣泛存在于果樹、蔬菜、花卉等植物中，病毒通過植物的無性繁殖在植物體內(nèi)傳遞及積累，最終造成植物生長受到抑制、產(chǎn)量及品質(zhì)下降。病毒感染是無性繁殖植物種質(zhì)退化、產(chǎn)量和品質(zhì)下降的主要原因。自從1952年Morel［1]利用感染花葉病毒的大麗菊莖尖分生組織培養(yǎng)得到無病毒植株以來，植物組培脫毒技術(shù)便在生產(chǎn)實踐中得到了廣泛應用。植物組培脫毒技術(shù)是利用病毒在植物體內(nèi)分布的不均勻性（在植物莖尖等分裂旺盛、生長迅速的組織細胞內(nèi)含量很低）及植物細胞的全能性，采用不含病毒的植物組織或細胞進行組織培養(yǎng)，利用植物細胞的全能性最終分化獲得無病毒植株。通過植物組培脫毒方法，可以脫除患病毒病植株的病毒，起到植株復壯，提高產(chǎn)量及質(zhì)量的作用。植物組培脫毒技術(shù)現(xiàn)已在馬鈴薯、甘薯、草莓、部分觀賞花卉及藥用植物的組培快繁中得到廣泛研究及應用，對其規(guī)?；?、標準化及區(qū)域化生產(chǎn)應用起到推動作用。

藏紅花（Crocus sativusL.）是鳶尾科番紅花屬多年生草本植物，主要靠分球無性繁殖。長期無性繁殖容易積累病毒，使品質(zhì)及產(chǎn)量下降。藏紅花主要病毒有蕪菁花葉病毒（Turnip mosaicvirus，TuMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、鳶尾花葉病毒（Irismosaicvirus，IMV）、煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）和菜豆黃花葉病毒（ByMV）［2-4]，通過組織培養(yǎng)的方式培育無病毒球莖是提高藏紅花種球質(zhì)量和產(chǎn)量的有效途徑。

本文綜述了植物組織培養(yǎng)脫毒的技術(shù)方法及其近幾年的應用情況，同時針對藥用植物藏紅花脫毒球莖培育中應用的脫毒技術(shù)做了總結(jié)及探討。

1 植物組織培養(yǎng)常用脫毒技術(shù)

1.1 莖尖培養(yǎng)脫毒

莖尖培養(yǎng)脫毒是利用病毒在植物體內(nèi)的分布不均勻性，在分裂旺盛的莖尖尤其是生長點區(qū)域（0.1-1.0 mm）帶病毒最少或不帶病毒，越靠近尖端，病毒含量越低。因為病毒在植物體內(nèi)隨維管系統(tǒng)遷移，在莖尖分生組織中沒有維管束系統(tǒng)，病毒通過胞間連絲傳遞比較慢，而細胞分裂速度快，所以莖尖生長點部位幾乎沒有病毒［5]。莖尖脫毒和再生的關(guān)鍵是切取莖尖的大小，因為脫毒的成功率與莖尖大小成反比，而再生能力與莖尖大小成正比，因此切取合適大小的莖尖分生組織是莖尖培養(yǎng)脫毒成功的關(guān)鍵［6]。莖尖培養(yǎng)具有脫毒效果好、繁殖系數(shù)高、變異率低的優(yōu)點，但也受到取材大小的限制。

自從1952年Morel［1]闡明用莖尖分生組織可從大麗菊中消除病毒以來，莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)在植物組織培養(yǎng)脫毒中得到廣泛研究與應用［7-12]，大量研究結(jié)果表明，0.2 mm左右的莖尖在脫毒率和成活率方面可以達到最優(yōu)。以0.2 mm莖尖為外植體，馬鈴薯的成活率和脫毒率分別為68%和56%［13]，葡萄的成活率和脫毒率為75%和12%［14]。

1.2 熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

由于莖尖培養(yǎng)受取材大小的限制，近年來在植物組織培養(yǎng)中多采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的方法脫毒，這種方法對于一些難于用莖尖培養(yǎng)或熱處理脫毒的果樹病毒效果很好。采用這種方法，即使用大的外植體，也能增加獲得的無病毒植株數(shù)。熱處理脫毒主要是利用病毒受熱的不穩(wěn)定性而失去其活性達到脫病毒的目的。熱處理過程減慢病毒在植株體內(nèi)擴散速度的同時加快植物的生長，針對不同植物、不同品種和不同植物病毒對溫度的敏感程度不同的特點，進行一定溫度和時間范圍的熱處理，使植物的生長速度明顯超過病毒在植物體內(nèi)擴散的速度，從而使一部分正在快速生長的植物組織，如頂芽、嫩稍的尖端不含病毒，把不含病毒的部分切下來接種到適宜的培養(yǎng)基上，最終培養(yǎng)出無毒植株［15]。

熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒的熱處理一般采用35-55℃的熱水或高溫蒸汽、高溫空氣處理，溫度越高處理的時間越短，處理時間根據(jù)溫度及外植體的不同從4 h-40 d不等，多采用熱處理結(jié)束后切取莖尖培養(yǎng)獲得無毒苗［16-19]。解曉紅等［16]用半夏無菌苗為外植體，38℃高溫40 d后切取莖尖培養(yǎng)，脫毒率達到88.9%。針對不同的材料選擇合適的熱處理溫度及時間，如40℃水浴熱處理草莓匍匐莖4 h［17]、36℃熱處理百合珠芽10 d［18]、38.5℃熱處理羅漢果組培苗10 d［19]，可獲得脫毒率為100%的無毒苗，

由于外植體成活率隨熱處理時間增加而降低，近幾年還發(fā)展出了變溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)來提高外植體成活率和脫毒率的方法。顧沛雯［20]研究了變溫處理對葡萄組培苗的脫毒效果，發(fā)現(xiàn)變溫（白天38℃，夜晚32℃）比恒溫（38℃）處理成活率提高15.6%，成活率達到50%，而脫毒率相差不大。同時與單純莖尖培養(yǎng)相比，熱處理后小株成活率和脫毒率平均增加7.5%和8.5%。石貴玉等［21]研究了毛葡萄的組培脫毒技術(shù)，發(fā)現(xiàn)變溫處理（白天 37℃處理8 h，晚上22℃處理16 h）10-15 d，莖尖存活率可達80%以上，脫毒率達100%。

1.3 愈傷組織誘導脫毒

愈傷組織誘導脫毒是通過植物器官或組織的培養(yǎng)來誘導產(chǎn)生愈傷組織，從愈傷組織分化出芽并長成植株，經(jīng)病毒檢測篩選獲得無毒植株的方法。愈傷組織誘導脫毒的應用中常結(jié)合莖尖培養(yǎng)及花藥培養(yǎng)等來提高脫毒效率。愈傷組織誘導脫毒技術(shù)現(xiàn)已在甘蔗、草莓和馬鈴薯等多種植物上獲得成功。

李松等［22]研究了甘蔗莖尖胚狀體脫毒苗快繁技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)莖尖胚狀體分化苗增殖5代后擴繁2 589倍，宿根矮化?。≧atoon stunting disease，RSD）病毒去除率95%、花葉病去除率100%。晁慧娟等［23]及肖君澤等［24]以花粉發(fā)育處于單核靠邊期的草莓花蕾為外植體進行花藥脫毒培養(yǎng)，結(jié)果表明預冷處理72 h是最適合的花藥低溫處理時間，研究還篩選出最適合花藥愈傷組織誘導及不定芽分化的培養(yǎng)基。

1.4 病毒抑制劑處理脫毒

病毒抑制劑能夠不同程度地脫除植物病毒，其作用機理主要為競爭寄主細胞表面受體、阻礙病毒穿入脫殼、阻礙病毒生物合成和提高寄主抗病能力4種方式。采用病毒抑制劑與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒方法，對取材大小要求不嚴并且能脫除多種病毒，接種莖尖可大于1 mm，容易分化出苗，提高存活率［25]。對于有些比較難脫除的病毒，采用病毒抑制劑結(jié)合熱處理和莖尖培養(yǎng)的方法使用，效果較好。

目前常用于組織培養(yǎng)的病毒抑制劑有9-（2-羥二氧）甲基鳥嘌呤、2-硫尿嘧啶、疊氮胸苷、DHT和病毒唑等。在眾多病毒抑制劑中，病毒唑的抑制效果較好，也得到了廣泛應用，研究發(fā)現(xiàn)35 mg/L病毒唑?qū)Σ煌贩N的馬鈴薯病毒脫除效果都可以達到60%-80%，比沒有添加病毒唑的莖尖處理脫毒效果提高27%［28]；40 mg/L和60 mg/L病毒唑?qū)疃徊《荆≒lum pox virus，PPV）的脫毒率達到15.38%和16.66%［29]。針對不同的材料需要研究合適的脫毒效果最好的病毒抑制劑，李正民等［26]研究了不同病毒抑制劑對蝴蝶蘭建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）的脫除效果，研究表明安吉寡糖素的脫毒效果最好，對CyMV的脫除率為83.33%，對ORSV的脫除率為66.67%；顧沛雯［20]研究發(fā)現(xiàn)病毒鈍化劑（WCT和豐源寶）處理對葡萄病毒具有良好的抑制作用。

在病毒抑制劑與其他脫毒方法結(jié)合使用方面，張惠華等［27]發(fā)現(xiàn)對東方百合進行熱處理（39℃處理15 d）后結(jié)合10 mg/L病毒唑來處理，百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV）及百合斑駁病毒（Lily mottle virus，LMoV）脫毒率分別達到55%和40%。

1.5 超低溫處理脫毒

超低溫處理脫毒是近些年發(fā)展起來的一種新的脫毒方法，其原理是利用液氮超低溫（-196℃）對植物細胞的選擇性殺傷，得到存活的頂端分生組織。頂端分生組織能夠在超低溫處理后存活，與其自身的細胞特性有關(guān)。含有病毒的細胞的液泡較大，液泡中含有的水分多，在超低溫處理過程中易被形成的冰晶破壞致死，而增殖速度較快的頂端分生組織含水分少，胞質(zhì)濃，抗凍性強，不宜被凍死。液氮中的超低溫能殺死含有較大液泡的細胞，而保存液泡小的頂端分生組織細胞，頂端分生組織不含或只含有少量病毒，因此得到的植株很有可能是無毒的。

超低溫脫毒方法最早由Brison等［30]開創(chuàng)，他們用超低溫結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法，成功的去除了李屬根狀莖上的李痘病毒（Plum pox virus，PPV），脫毒率達到50%，是莖尖剝離脫毒率19%的2.5倍。Wang等［32，33]應用該技術(shù)做了大量研究，將該技術(shù)應用于馬鈴薯、甘薯、葡萄等植物，并獲得了無毒植株，同時還將超低溫處理、熱處理及莖尖培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來脫除了木莓叢矮病毒（Raspberry bushy dwarf virus，RBDV）脫毒率達到35%。Helliot等［31]利用超低溫脫毒方法，從香蕉中脫除黃瓜花葉病毒及香蕉條斑病毒（Banana streak virus，BSV），病毒脫毒率達到30%和90%。靳慧潔等［34]結(jié)合超低溫脫毒、莖尖培養(yǎng)及熱處理脫毒方法成功獲得了百合脫毒苗。超低溫處理脫毒基于超低溫保存，理論上，只要能利用超低溫保存種質(zhì)的植物都可以用超低溫處理進行脫毒，其應用前景非常廣闊［35，36]。

2 藏紅花脫毒種球培育方法

由于藏紅花葉基生，沒有一般意義的莖，其生長點位于葉叢基部與球莖結(jié)合處，剝?nèi)∑淝o尖難度極大，同時0.5 mm以下微莖尖成活率低，剝?nèi)‰y度大，而較大莖尖一般脫毒效果不佳［2]，現(xiàn)有藏紅花脫毒球莖培育研究多采用莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理、愈傷組織誘導及病毒抑制劑等方法才能獲得較高的成活率及脫毒率。

朱保華等［2]采用變溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)與化學處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)2種方法培育出了不含CMV、TuMV、TRV及IMV病毒的藏紅花植株。將帶芽點的球莖進行變溫處理36℃（12 h）/18℃（12 h）后，剝?nèi)?.5-1.0 mm的莖尖進行培養(yǎng)，莖尖成活率26.7%；將3-5 cm帶葉片的球莖滅菌后取0.5-1.0 mm的莖尖接種到添加5-10 mg/L濃度病毒唑的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，莖尖成活率25%-45%。陳書安等［3]用熱處理結(jié)合愈傷組織誘導方法獲得了無毒芽，以高溫處理（35℃）的分化芽為外植體，經(jīng)誘導25 d后獲得愈傷組織，該愈傷組織再經(jīng)過高溫處理（35℃）可獲得高溫脫毒的藏紅花愈傷組織，再分化培養(yǎng)50 d后可獲得高溫脫毒的藏紅花分化芽。朱昱等［37]采用莖尖培養(yǎng)結(jié)合愈傷組織誘導方法也獲得了脫毒球莖。

3 結(jié)語

通過組織培養(yǎng)脫毒可以提高作物產(chǎn)量及質(zhì)量，組培脫毒技術(shù)也得到越來越多的研究與應用，目前通過組培實現(xiàn)商業(yè)化的脫毒試管苗在果樹、蔬菜、花卉及藥用植物上的研究已經(jīng)十分普遍，如馬鈴薯、甘薯、蘋果、葡萄、草莓、蝴蝶蘭、天山雪蓮和金線蓮等。植物組培脫毒技術(shù)的不斷改進和提高以適應大規(guī)模的工廠化和商品化勢在必行。脫毒技術(shù)的應用也逐步從莖尖培養(yǎng)、熱處理脫毒、病毒抑制劑處理等單一脫毒方法向2種、3種方法結(jié)合使用發(fā)展，逐步提高脫毒率及成苗率。

目前藏紅花組織培養(yǎng)方面的研究多集中在通過球莖切塊來分化成芽或通過球莖切塊誘導愈傷組織并進一步分化成芽的快繁研究［38-41]，對于脫毒球莖的研究報道很少。球莖切塊直接誘導分化成芽不能達到脫毒的目的，通過誘導愈傷組織分化成芽雖然增殖系數(shù)比球莖直接誘導成芽高，而且有可能獲得無毒植株，但是脫毒率低。由于藏紅花難于直接剝?nèi)?.5 mm以下莖尖來進行莖尖培養(yǎng)，同時球莖取材相對容易、組培快繁方面（球莖切塊誘導愈傷組織及直接分化成芽）的研究較多，為藏紅花培育脫毒球莖提供了新的研究思路，因此通過球莖切塊誘導愈傷組織結(jié)合熱處理或病毒抑制劑處理將是藏紅花無毒球莖培育的有效途徑。

［1] Morel G, Martin C. Guérison de dahlias atteints d’une maladieá virus ［J] . C R Hebd Seances Acad Sci, 1952, 235：1324-1325.

［2] 朱保華. 番紅花（Crocus sativusL.）離體快繁及無病毒植株的培育［D] . 重慶：西南大學, 2009.

［3] 陳書安, 陳文浩, 王曉東, 等. 無毒藏紅花組培芽的獲取及其病毒檢測［J] . 高技術(shù)通訊, 2006, 16（11）：1170-1175.

［4] 謝禮, 呂明芳, 董峰麗, 等. 藏紅花病毒病原的分子鑒定［J] .中草藥, 2013, 44（8）：1033-1036.

［5] 朱玉賢, 李毅. 現(xiàn)代分子生物學［M] . 北京：高等教育出版社,1997：410-414.

［6] Hadid A, Khetarpal RK, Koganezawa H. Plant virus diseases control［C] . Am Phyto Soc, St Paul Brazil, 1998：346-380.

［7] Maliogka VI, Skiada FG, Eleftheriou EP, et al. Elimination of a new ampelovirus（GLRaV-Pr）and grapevine rupestris stem pitting associated virus（GRSPaV）from two vitis vinifera cultivars combiningin vitrothermotherapy with shoot tip culture ［J] . Sci Hort, 2009, 123（2）：280-282.

［8] Singh MK, Chandel V, Hallan V, et al. Occurrence of peanut stripe virus on patchouli and raising of virus-free patchouli plants by meristem tip culture ［J] . J Plant Dis Protect, 2009, 116（1）：2-6.

［9] Retheesh ST, Bhat AI. Simultaneous elimination of cucumber mosaic virus and cymbidium mosaic virus and cymbidium mosaic virus infectingVanilla planifoliathrough meristem culture ［J] . Crop Protect, 2010, 29（10）：1214-1217.

［10] 丁海兵, 宋吉軒, 顏謙, 等. 甘薯脫毒種薯（苗）生產(chǎn)技術(shù) ［J] .貴州農(nóng)業(yè)科學, 2011, 39（5）：84-86.

［11] 苗利娟, 韓鎖義, 張新友, 等. 懷山藥莖尖脫毒培養(yǎng)與莖段增殖研究 ［J] . 河南農(nóng)業(yè)科學, 2011, 40（11）：123-125.

［12] 周志林, 唐君, 曹清河, 等. 若干甘薯優(yōu)良品種脫毒培養(yǎng)研究初報［J] . 江西農(nóng)業(yè)學報, 2011, 23（10）：34-35.

［13] 陸春霞, 梁貴秋, 唐燕梅. 馬鈴薯莖尖脫毒、復壯及病毒檢測研究［J] . 西南師范大學學報：自然科學版, 2010, 35（1）：111-114.

［14] Wang QC, Munir M, Li P, et al. Elimination of grapevine virus A（GVA）by cryopreservation of in vitro-grown shoot tips ofVitis viniferaL. ［J] . Plant Sci, 2003, 165：321-327.

［15] 許傳俊, 黃珺梅, 曾碧玉, 等. 植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)研究進展［J] . 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2011, 39（3）：1318-1320.

［16] 解曉紅, 李江輝, 陳麗, 等. 半夏脫毒技術(shù)研究及應用［J] .中藥材, 2011, 34（7）：1014-1017.

［17] 李志強, 王晶, 丁國亮, 等. 草莓熱處理結(jié)合莖尖脫毒技術(shù)研究［J] . 北方園藝, 2012（5）：125-127.

［18] 周曉波, 吳藝飛, 丁茁荑. 卷丹百合脫毒快繁技術(shù)研究［J] .中國農(nóng)學通報, 2012, 28（31）：201-205.

［19] 吳群英, 李伯林, 李景云. 羅漢果莖尖脫毒技術(shù)研究［J] . 北方園藝, 2013, 3：102-104.

［20] 顧沛雯. 葡萄卷葉病毒的脫毒技術(shù)研究［J] . 西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版, 2008, 36（5）：85-91.

［21] 石貴玉, 陳耕云, 廖文雪. 毛葡萄組織培養(yǎng)的脫毒技術(shù)［J] .廣西師范大學學報：自然科學版, 2008, 26（3）：71-74.

［22] 李松, 余坤興, 劉麗敏, 等. 甘蔗莖尖胚狀體脫毒苗快繁技術(shù)研究［J] . 江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2011, 39（2）：83-87.

［23] 晁慧娟, 劉敏, 姬謙龍, 等. ‘甜查理’草莓花藥培養(yǎng)脫毒技術(shù)［J] . 北京農(nóng)學院學報, 2010, 25（2）：18-21.

［24] 肖君澤, 黃益鴻, 姜放軍, 等. 章姬草莓花藥組織培養(yǎng)脫毒快速繁殖技術(shù)的研究［J] .江西農(nóng)業(yè)學報, 2011, 23（10）：49-50.

［25] 孫琦, 張春慶. 植物病毒與檢測研究進展［J] . 山東農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版, 2003, 34（2）：307-310.

［26] 李正民, 王安石, 王健, 等. 病毒抑制劑對蝴蝶蘭病毒植株的脫毒效果［J] . 熱帶生物學報, 2013, 4（1）：56-60.

［27] 張惠華, 劉曉榮, 顏范悅, 等. 東方百合綜合脫毒技術(shù)研究［J] .遼寧農(nóng)業(yè)科學, 2009, 6：17-19.

［28] Danci O, Erdei L, Vidacs L, et al. Influence of orbavirin on potato plants regeneration and virus eradication ［J] . J Hort, 2009, 12：421-425.

［29] Paunovic S, Ruzic D, Vujovic T, et al.In vitroproduction of plumpox virus free plums by chemotherapy with robavorin ［J] .Biotechol & Biotechnol EQ, 2007, 4：417-421.

［30] Brison M, de Boucaud MT, Pierronnet A, et al. Effect of cryopreservation on the sanitary state of a cv.Prunusrootstock experimentally contaminated with plum pox potyvirus ［J] . Plant Sci, 1997, 123：189-196.

［31] Helliot B, Panis B, Poumay Y, et al. Cryopreservation for the elimination of cucumber mosaic and banana streak viruses from banana（Musa spp.）［J] . Plant Cell Rep, 2002, 20：1117-1122.

［32] Wang QC, Valkonen JPT. Elimination of two viruses which interact synergistically from sweetpotato by shoot tip culture and cryotherapy ［J] . J Virol Methods, 2008, 154：135-145.

［33] Wang QC, Wilmer JC, Minna-Liisa R, et al. Combined thermotherapy and cryotherapy for efficient virus eradication：relation of virus distribution, subcellular changes, cell survival and viral RNA degration in shoot tips ［J] . Mol Plant Pathol, 2008, 9（2）：237-250.

［34] 靳慧潔. 東方百合病毒檢測與莖尖超低溫脫毒研究［D] . 福州：福建農(nóng)林大學, 2009.

［35] Wang QC, Jari PTV. Cryotherapy of shoot tips：novel pathogen eradication method ［J] . Trends in Plant Science, 2009, 14（3）：119-122.

［36] 楊智, 陳春伶, 徐美隆. 超低溫處理植物脫毒研究進展［J] .北方園藝, 2013（12）：184-187.

［37] 朱昱. 番紅花球莖脫毒、快速繁殖及藥效學研究［D] . 上海：第二軍醫(yī)大學, 2007.

［38] 王壽芹, 趙永欽, 劉莉莎, 等. 藏紅花愈傷組織的誘導及植株再生［J] . 西南農(nóng)業(yè)學報, 2011, 24（1）：369-372.

［39] 汪洋, 韓婷, 朱昱, 等. 番紅花組織培養(yǎng)及快速繁殖研究［J] .中草藥, 2009, 40（5）：807-809.

［40] 陳書安, 王曉東, 趙兵, 等. 應用稀土調(diào)控藏紅花胚性愈傷組織的生長與分化［J] . 植物學報, 2010, 45（5）：609-614.

［41] 袁麗紅, 陸玉婷, 黃晶. 藏紅花愈傷組織誘導和褐化抑制［J] .南京工業(yè)大學學報, 2009, 31（6）：21-26.