穆琳瑛， 王滿蘋， 王 順， 王婷婷， 曹百穹， 孫曉輝, 朱娟花， 胡建東

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)大迅捷測試技術(shù)有限公司,河南 鄭州 450002)

光學(xué)表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)生物傳感技術(shù)是一種先進(jìn)的、多用途的免標(biāo)記光學(xué)生物檢測技術(shù)，它涉及光學(xué)工程、機(jī)械工程、電子工程和生物化學(xué)等多個(gè)學(xué)科[1].由于SPR生物傳感技術(shù)具有實(shí)時(shí)、快速、無需標(biāo)記及靈敏度高等特點(diǎn)，得到了人們極大的關(guān)注，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測、生物醫(yī)學(xué)和藥物篩選等領(lǐng)域[2～8].植物激素的研究幾乎涉及到植物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，例如植物激素調(diào)控機(jī)制的研究已成為人們認(rèn)識(shí)和理解紛繁神秘植物生命現(xiàn)象的重要途徑，使本身就處于科學(xué)前沿的植物激素研究進(jìn)入全新的快速發(fā)展階段[9].植物激素脫落酸(Abscisic acid, ABA)就是一種幾乎存在于所有高等植物中的植物激素[9].植物激素ABA不僅在植物發(fā)育的諸多重要過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而且也作為植物體內(nèi)重要的逆境響應(yīng)激素，與干旱、高鹽、低溫、損傷、低氧、光照以及病原體侵染等多種生物和非生物脅迫有關(guān)，是植物體響應(yīng)逆境脅迫信號(hào)，也是引起植物適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)和基因表達(dá)的重要因子[10,11].植物激素ABA的測定最早采用生物測試方法，隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將免疫學(xué)技術(shù)應(yīng)用于植物激素ABA的測定則更有力地促進(jìn)了ABA定量研究的發(fā)展.現(xiàn)今酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和酶標(biāo)免疫測定法(EIA)已是測定植物ABA含量的重要手段[12,13].物理化學(xué)方法中的色譜學(xué)也是測定植物激素ABA常見的方法，其利用物質(zhì)在不同介質(zhì)中的分配原理進(jìn)行測定，包括紙上層析、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、薄層層析(TLC)以及氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)等[14～24].近幾年，光學(xué)SPR生物傳感技術(shù)用于植物激素的快速檢測引起了國際相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)家的高度重視[25].本研究采用光學(xué)SPR生物傳感技術(shù)間接抑制法測定植物激素ABA的含量，建立了一種快速、低檢測限的測定植物激素ABA含量新方法.

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1儀器與試劑

1.1.1 儀器 光學(xué)生物傳感器TSPR1K23從美國德州儀器公司(Texas Instruments，TI)公司購買，內(nèi)部集成封裝了光學(xué)檢測系統(tǒng)，在光學(xué)生物傳感器表面蒸鍍了50nm金膜，用于產(chǎn)生表面等離子共振光譜.光學(xué)SPR生物傳感器測定植物激素ABA的裝置系自行設(shè)計(jì).

1.1.2 試劑 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(美國Sigma公司)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基炭二亞胺鹽酸鹽(EDC)(美國Sigma公司)，半胱胺鹽酸鹽(AET)，牛血清白蛋白(BSA)，乙醇胺(Eth)，PBS緩沖液，ABA標(biāo)準(zhǔn)品，ABA單克隆抗體(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供)，高氯酸、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、去離子水均為分析純.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 光學(xué)SPR生物傳感器檢測ABA原理 光學(xué)SPR生物傳感器測定ABA的原理實(shí)質(zhì)是對(duì)耦聯(lián)在金膜表面的ABA分子質(zhì)量進(jìn)行檢測.SPR生物傳感器檢測ABA的原理見圖1.集成光學(xué)生物傳感器為非掃描性光學(xué)SPR生物傳感器，將光束以一定角度入射到表面蒸鍍50 nm金膜的高折射率的光學(xué)棱鏡上，光線從該界面產(chǎn)生全反射，全反射產(chǎn)生的倏逝波引起金膜內(nèi)的自由電子產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)，形成表面等離子波，當(dāng)表面等離子波的傳播常數(shù)與入射光的傳播常數(shù)匹配時(shí)，表面等離子波將產(chǎn)生共振.將ABA抗原固定在金膜的表面，通過間接抑制法使樣品溶液中未反應(yīng)完全的ABA抗體與抗原結(jié)合，從而引起金膜表面微小量的物質(zhì)量的變化.金膜表面物質(zhì)量的變化會(huì)引起表面等離子波共振波長的改變從而反映ABA抗原抗體結(jié)合情況，即可獲得被測樣品中的ABA含量.

圖1 光學(xué)SPR生物傳感器檢測ABA原理

間接抑制法是將ABA抗原通過巰基丙酸固定在光學(xué)棱鏡的金膜上制成分子識(shí)別膜.分析時(shí)需要先進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，預(yù)反應(yīng)時(shí)在檢測樣本中加入定量且過量的ABA抗體，抗體和樣本混合后孵育，使樣本中ABA抗原和ABA抗體結(jié)合達(dá)到平衡狀態(tài)，之后再通過光學(xué)SPR生物傳感器表面分子識(shí)別膜，檢測未被結(jié)合的自由抗體分子.間接抑制法的檢測過程見圖2.抗原濃度越高，分子識(shí)別膜上結(jié)合自由抗體分子越少，即結(jié)合的分子質(zhì)量與樣本中抗原濃度成反比關(guān)系.

圖2 光學(xué)SPR生物傳感器間接抑制法

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 光學(xué)SPR生物傳感器測定植物激素ABA的裝置如圖3所示，它由集成光學(xué)SPR傳感器、微流池、蠕動(dòng)泵、光學(xué)響應(yīng)信號(hào)采集電路以及處理軟件組成.樣本溶液經(jīng)過微流池在SPR生物傳感器上產(chǎn)生表面等離子共振現(xiàn)象，使得從光學(xué)生物傳感器的反射光光強(qiáng)發(fā)生變化，這一變化被光電響應(yīng)信號(hào)采集電路處理采集后在觸摸屏上實(shí)時(shí)顯示，包括生物分子整個(gè)結(jié)合與解離的動(dòng)態(tài)過程和光學(xué)SPR共振信號(hào).同時(shí)，流經(jīng)傳感器表面的樣本經(jīng)蠕動(dòng)泵進(jìn)入廢液缸.

圖3 ABA檢測原理裝置圖

1.2.3 ABA分子識(shí)別膜制備 (1) 首先向傳感器金膜表面以30 μL·min-1的流速注入PBS緩沖液，待基線趨于穩(wěn)定后，向金膜表面注入 0.01 mol·L-1的AET，實(shí)時(shí)監(jiān)控響應(yīng)曲線，直至響應(yīng)信號(hào)趨于穩(wěn)定，停止注入，用緩沖液沖洗，待信號(hào)穩(wěn)定，從而在金膜表面固定1層氨基.(2) 注入用0.1 mol·L-1NHS和0.4 mol·L-1EDC活化后的BSA溶液，使其更容易和AET上氨基結(jié)合，活化時(shí)間1 h.(3) 注入活化的100 ng·L-1的ABA抗原，實(shí)時(shí)監(jiān)控響應(yīng)曲線，待響應(yīng)信號(hào)趨于穩(wěn)定，停止注入，用PBS緩沖液沖洗，至信號(hào)穩(wěn)定，這樣ABA抗原便固定在金膜上.(4) 最后注入1 mol·L-1乙醇胺溶液，封閉金膜上未被ABA抗原結(jié)合的活性位點(diǎn)，完成分子識(shí)別膜的制備.

1.2.4 測試過程 將定位抗體的質(zhì)量濃度為0.575 g·L-1.分別加入0，25，50，200，500，1 000 mg·L-1不同質(zhì)量濃度的抗原.按抗原質(zhì)量濃度從大到小的順序進(jìn)行測試，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為0.3 r·min-1.

2 結(jié)果與分析

2.1ABA在金膜上的固定

ABA按1.2.3的方法在金膜上固定，在金膜表面流過AET,AET分子一端巰基與金膜相聯(lián)，另一端氨基與NHS/EDC活化的BSA中的羧基相連，BSA較好的固定在傳感器表面.之后傳感器表面流過ABA抗原，ABA中的羧基與BSA分子上的氨基耦合，再用乙醇胺對(duì)金膜表面未結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉，完成ABA分子識(shí)別膜的制備，如圖4所示， ABA較好的固定在金膜上.

圖4 ABA的固定及剩余活性位點(diǎn)的封閉

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將定位抗體質(zhì)量濃度稀釋至0.575 g·L-1后，與不同質(zhì)量濃度抗原混合(0，25，50，200，500，1 000 mg·L-1)，對(duì)混合物依次進(jìn)行測試得到一定時(shí)間段內(nèi)不同抗原質(zhì)量濃度的響應(yīng)值(RU)的關(guān)系.隨著ABA抗原質(zhì)量濃度依次增加，其響應(yīng)值依次減小，即抗原質(zhì)量濃度越大發(fā)生共振的時(shí)候光強(qiáng)越弱.對(duì)應(yīng)到圖中就是響應(yīng)值越低，響應(yīng)值隨抗原添加量的增加而減少，符合競爭抑制性檢測規(guī)律，且各質(zhì)量濃度間具有很好的區(qū)分度.

取適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)不同質(zhì)量濃度抗原樣品的響應(yīng)值，并與所對(duì)應(yīng)的抗原質(zhì)量濃度作圖(圖5).

對(duì)該響應(yīng)結(jié)果做曲線擬合，擬合方程為RU=157.655 36-1.732 24c，相關(guān)系數(shù)為-0.998.由此可知，當(dāng)抗體稀釋后，信號(hào)響應(yīng)值和ABA抗原質(zhì)量濃度成反比關(guān)系，并且具有很好的線性關(guān)系.由此建立了利用光學(xué)SPR技術(shù)采用間接抑制方法檢測ABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

圖5 ABA質(zhì)量濃度與SPR響應(yīng)信號(hào)之間的關(guān)系

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

從樣品中挑選取質(zhì)量濃度200 mg· L-1ABA抗原連續(xù)檢測6次(蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為0.3 r·min-1，每次6 min)，實(shí)時(shí)監(jiān)控響應(yīng)值分別為123，134，126，136，129，138.重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果求得RSD=4.13%.可見檢測重復(fù)性良好.

3 結(jié)論

本研究采用便攜式光學(xué)表面等離子共振生物傳感器快速檢測植物激素脫落酸.將植物激素ABA的抗原固定于傳感芯片表面，利用間接抑制法測定ABA含量.分別將0，25，50，200，500，1 000 mg·L-1的ABA抗原添加入ABA抗體溶液中進(jìn)行競爭反應(yīng)，將反應(yīng)后的分析物流經(jīng)光學(xué)SPR芯片表面，建立了ABA測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)為-0.998，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果求得RSD=4.13%.研究結(jié)果顯示，該方法能夠快速檢測ABA的含量，具有樣品無需標(biāo)記、重復(fù)性好和快速定量等特點(diǎn)，為植物激素ABA的快速測定提供了一種新穎的定量檢測方法.

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