劉向陽, 劉愛勤, 周 琳

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002; 2.河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002; 3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533)

胡椒(PipernigrumL.)原產(chǎn)印度，現(xiàn)廣泛栽培于熱帶國(guó)家和地區(qū)[1].中國(guó)于1947年對(duì)胡椒進(jìn)行引種，目前種植面積和胡椒產(chǎn)量世界排名分別為第6位和第5位[2].對(duì)于包括中國(guó)在內(nèi)的很多東南亞國(guó)家來說，胡椒是用來賺取外匯的最重要的香辛料之一[3].胡椒的種植面積雖然在近些年來持續(xù)增長(zhǎng)，但其產(chǎn)量和質(zhì)量常受到生物或非生物因素的影響而大幅降低.在影響胡椒生產(chǎn)的生物因素中，胡椒病毒病作為胡椒重要病害之一，危害日益突出，嚴(yán)重地區(qū)發(fā)病率高達(dá)80%以上[4].胡椒病毒病在世界許多胡椒產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，包括中國(guó)云南、海南、廣東、廣西及福建等產(chǎn)區(qū).侵染胡椒的病毒主要有2種，分別為胡椒黃斑病毒(Piperyellow mottle virus, PYMV)和黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)[5, 6].PYMV和CMV是不同屬的病毒，但二者侵染胡椒后引起的胡椒感病癥狀極為相似，均表現(xiàn)為花葉癥狀，即感病胡椒葉脈清亮透明，葉片出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)、變小、扭曲等[7～9].因此，僅從感病癥狀難以辨別胡椒花葉病的病原.牛立霞等[6]通過巢式RT-PCR方法鑒定了海南胡椒花葉病的病原為CMV，中國(guó)的其他產(chǎn)區(qū)胡椒花葉病的病原還有待鑒定.云南是中國(guó)胡椒主產(chǎn)區(qū)之一，該產(chǎn)區(qū)內(nèi)胡椒花葉病時(shí)有發(fā)生.本研究以云南感染花葉病的胡椒為對(duì)象，以海南感病胡椒為參照，利用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)對(duì)致病病毒進(jìn)行鑒定，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)對(duì)CMV外殼蛋白(Coat protein, CP)基因進(jìn)行擴(kuò)增和克隆，并依據(jù)CMVcp核酸序列對(duì)CMV進(jìn)行亞組鑒定.該研究旨在為胡椒病毒病的診斷和綜合防治以及轉(zhuǎn)基因抗病毒胡椒品系的選育奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1感病材料

典型感病的胡椒葉片(葉色斑駁，形似馬賽克，葉片變小、皺縮、卷曲、畸形)分別采自云南德宏和海南萬寧的胡椒種植園，置于-20 ℃冰箱備用.

1.2方法

1.2.1 DAS-ELISA檢測(cè) 樣品分為4類，分別為樣品1(無病健康胡椒葉片，陰性對(duì)照)、樣品2(感病黃瓜葉片，陽性對(duì)照)、樣品3(海南胡椒病葉，陽性對(duì)照)和樣品4(云南胡椒病葉).樣品用洗滌緩沖液(PBST，pH 7.4，NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KH2PO40.2 g，KCl 0.2 g)+2%聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)溶液(體積比為1∶5)研磨.參照Agdia公司CMV檢測(cè)試劑盒(CMV DAS-ELISA Kit)操作說明書進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè).

利用樣本與陰性對(duì)照吸光度的比值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性：I/H≥ 2；陰性：I/H< 2；I/H=(樣品的平均吸光值-空白對(duì)照平均吸光值)/(陰性對(duì)照的平均吸光值-空白對(duì)照平均吸光值)

1.2.2 胡椒葉片總RNA的提取 分別稱取100 mg采自云南和海南的胡椒病葉，用液氮研磨成粉，轉(zhuǎn)入1.5 mLRNase-free離心管中，然后按照E.Z.N.A.?植物總RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Plant RNA Kit)操作說明書完成后續(xù)步驟，提取的胡椒病葉總RNA置-20 ℃冰箱備用.

1.2.3 CMVcp單鏈cDNA的合成 以上述提取的胡椒病葉總RNA為模板，參照TaKaRa公司的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶操作說明，合成CMVcp第1鏈cDNA.

1.2.4 CMVcp基因的克隆和測(cè)序 根據(jù)CMV亞組I外殼蛋白基因序列，經(jīng)Primer Premier 6.0軟件(加拿大Premier公司)設(shè)計(jì)1對(duì)引物(Cp-F和Cp-R)，具體序列見表1.

表1 試驗(yàn)所用引物

分別取10×Buffer 5 μL、Cp-F和Cp-R引物(10 mmol·L-1)各1 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)1 μL，Taq聚合酶1 μL，cDNA模板0.4 μL于200 μL離心管中，用雙蒸水補(bǔ)至50 μL.設(shè)定PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠驗(yàn)證后，用E.Z.N.A.TM膠回收試劑盒(E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit)進(jìn)行回收.

將純化回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple載體于4 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素(100 g·L-1)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)(250 r·min-1)14 h，取少量菌液提質(zhì)粒，質(zhì)粒酶切鑒定后委托上海英駿(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司測(cè)序.

1.2.5 CMVcp基因的序列分析 序列的分子量用DNAstar V5.0.6預(yù)測(cè).同源序列搜尋在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)通過BLAST程序進(jìn)行.用Clustal X 2.0[10]對(duì)搜索到的CMVcp基因同源序列(表2)進(jìn)行雙重和多重比對(duì)，隨后用MEGA 4[11]以N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行1 000次重復(fù)，分析序列間可能的親緣關(guān)系.

表2 用作比對(duì)的CMV cp基因序列

2 結(jié)果與分析

2.1胡椒花葉病病原檢測(cè)

DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，采自海南的胡椒病葉(樣品3)和采自云南的胡椒病葉(樣品4)提取液與CMV抗血清反應(yīng)均呈陽性，二者的I/H值分別為3.04和3.48(表3)，均大于2.0，因此可以認(rèn)定，與海南胡椒花葉病病原一樣，云南胡椒花葉病的病原也為CMV.將云南和海南兩地侵染胡椒的CMV分別命名為云南胡椒分離物(CMV isolated from Yunnan provinces, CMV-YNP)和海南胡椒分離物(CMV isolated from Hainan provinces, CMV-HNP).

2.2CMVcp基因RT-PCR擴(kuò)增及克隆

分別以Cp-F和Cp-R為正反引物，擴(kuò)增CMV-YNPcp和CMV-HNPcp基因.0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，兩地胡椒病樣的擴(kuò)增產(chǎn)物均在約660 bp處出現(xiàn)1條明顯的DNA條帶，大小與已知CMVcp基因相對(duì)分子質(zhì)量相當(dāng)(圖1)，初步認(rèn)定二者為CMVcp基因.分別將CMV-YNPcp和CMV-HNPcp基因條帶回收，連接到pMD 18-T simple載體，命名為pT-CPYNP和pT-CPHNP.

表3 DAS-ELISA法測(cè)定結(jié)果

M.DNA質(zhì)量分子標(biāo)準(zhǔn)；1, 3.健康樣品(陰性對(duì)照)；2.海南染病樣品；4.云南染病樣品.

2.3CMVcp基因的序列分析

分別取少量經(jīng)酶切驗(yàn)證的pT-CPYNP和pT-CPHNP菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)在線分析證實(shí)二者確為CMVcp基因.序列一致性分析表明，CMV-YNPcp與從云南省南瓜感病植株中分離的CMV-YNcp基因(GenBank登錄號(hào)：DQ459482)核酸序列相似性最高，為97%；CMV-HNPcp則分別與從海南省感病胡椒中分離的CMV-Chinacp基因(GenBank登錄號(hào)：EU926956)和從海南省感病雞蛋果中分離的CMV-Pfcp基因(GenBank登錄號(hào)：AF368192)核酸序列相似性最高，均為98%.CMV-YNP與CMV-HNP雖然寄主同為胡椒，但二者的cp基因核酸序列相似性并不高，僅為93%.CMV-HNPcp和與從印度卡納塔克邦感病胡椒中分離的CMVcp基因(GenBank登錄號(hào)：AY545924)核算序列相似性為92%，CMV-YNPcp與該序列的相似性稍高，但也僅為94%.CMV-YNPcp和CMV-HNPcp基因全長(zhǎng)657 bp，編碼218個(gè)氨基酸(圖2和圖3).將CMV-YNPcp和CMV-HNPcp基因核酸序列提交到NCBI，獲得GenBank登錄號(hào)分別為JQ692129和JQ895557.

BLAST搜索結(jié)果表明，與CMV-YNP和CMV-HNP序列相似性程度高的CMV多來自中國(guó)，其次是距離中國(guó)較近的日本.為了確定CMV-YNP和CMV-HNP的亞組歸屬，以具有代表性的CMVcp基因(表2)作為參照，選擇N-J法構(gòu)建了29個(gè)CMV株系或分離物的進(jìn)化樹(圖4).系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，CMV株系或分離物明顯分為2個(gè)亞組，即亞組I和亞組II，而亞組I又進(jìn)一步分為亞組IA和IB.CMV-HNP(圖4，星號(hào)所指)、CMV-YNP(圖4，箭頭所指)與從印度卡納塔克邦感病胡椒中分離的CMVcp基因(In-Pn，圖4)均歸屬于CMV亞組IB，但是這3個(gè)侵染胡椒的CMV在系統(tǒng)進(jìn)化樹中并沒有聚在一起.CMV-YNP與其它6個(gè)CMV分離物聚為1簇，在這6個(gè)與CMV-YNP進(jìn)化關(guān)系最接近的CMV分離物中，4個(gè)來自中國(guó)，另外2個(gè)分別來自韓國(guó)和保加利亞.同為從胡椒寄主中分離的CMV-HNP沒能和其它28個(gè)CMV株系或分離物中的任何1個(gè)聚為1簇，而是獨(dú)自形成1個(gè)分支(圖4).

圖2 CMV-YNP cp核酸和氨基酸序列

圖3 CMV-HNP cp核酸和氨基酸序列

圖中CMV株系名稱與表2相對(duì)應(yīng).箭頭所指為CMV cp-YNP，星號(hào)所指為CMV cp-HNP，分枝上的數(shù)值為支持率(bootstrap values)， 圖下部的比例尺代表進(jìn)化距離.

3 討論

CMV和PYMV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，本是不同屬的病毒，但二者侵染胡椒后，均可以引起感病胡椒表現(xiàn)出花葉癥狀，僅從感病胡椒表現(xiàn)的癥狀難以確定病原，因此為胡椒花葉病的防治帶來了困難.CMV是直徑為27～30 nm的球形RNA病毒，PYMV是無包膜的桿狀病毒(30 nm×120 nm)，具有雙鏈DNA[5, 8]，在電鏡下較容易將二者區(qū)分開來.本研究首先采用DAS-ELISA法，檢測(cè)到云南和海南感病胡椒葉片中的病毒為CMV，隨后根據(jù)CMVcp基因末端保守序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR從病葉總RNA中克隆出cp基因，并依據(jù)測(cè)得的CMVcp基因序列對(duì)侵染胡椒的CMV進(jìn)行亞組鑒定.

本研究通過雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法鑒定了云南胡椒花葉病的病原為CMV，為胡椒花葉病的防治提供了依據(jù).CMV具有典型的三分體(RNA 1，RNA 2和RNA 3)單鏈正義RNA病毒的特點(diǎn)，其中RNA 3編碼2個(gè)蛋白質(zhì)，即3a運(yùn)動(dòng)蛋白和外殼蛋白.根據(jù)血清學(xué)特征及核酸序列的相似性，CMV可分為2個(gè)亞組，即亞組I和亞組II，隨著研究的深入，CMV亞組I又進(jìn)一步分為亞組IA和IB[12].作為RNA病毒，CMV較易發(fā)生變異，特別是RNA 3，最易發(fā)生重組變異[13].CMVcp基因序列比較表明，CMV-YNP與CMV-HNP雖然寄主同為胡椒，但二者的cp基因核酸序列差異較大，一致性僅為93%；CMV-YNPcp與從印度卡納塔克邦感病胡椒中分離的CMVcp基因的相似性稍高，但也僅為94%，同源性較低.該部分試驗(yàn)從分子水平上證實(shí)了CMV-YNP與上述2個(gè)CMV胡椒分離物屬于不同的株系.

從寄主上看，CMV-YNP、CMV-HNP和In-Pn 3個(gè)CMV株系均是從胡椒中分離，即便CMV-HNP、CMV-YNP和In-Pn在系統(tǒng)進(jìn)化樹中同屬CMV IB亞組，但三者并沒有聚在一簇，而是各自分開，特別是CMV-HNP，獨(dú)自形成一個(gè)小的分支(圖4)，這或許表明寄主并非CMV發(fā)生、進(jìn)化、變異的唯一決定因素.序列比對(duì)顯示，與CMV-YNPcp基因核酸序列相似性最高的CMV株系并不是分離于同樣寄主的胡椒，而是分離于相近地域(云南昆明)感病南瓜，這或許預(yù)示CMV株系分化、變異具有地域性，而感染胡椒的CMV或許來自于當(dāng)?shù)氐钠渌胁∥锓N.

胡椒花葉病的危害日趨嚴(yán)重，但目前仍然沒有理想藥劑能對(duì)其進(jìn)行直接有效地防治.此外，國(guó)內(nèi)外尚未篩選出對(duì)胡椒花葉病具有抗性的胡椒品系，所以對(duì)胡椒花葉病的防治措施僅限于清除感病植株和加強(qiáng)檢疫以防止其擴(kuò)散.CMV不僅是胡椒花葉病的病原，而且是番茄病毒病的主要病原之一.已有報(bào)道表明，將CMVcp基因?qū)敕鸦蚪M中進(jìn)行表達(dá)，可以有效防治CMV對(duì)番茄的侵染[14].本研究在鑒定了胡椒花葉病的病原為CMV的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了cp基因的克隆，從而為獲得抗CMV的轉(zhuǎn)cp基因胡椒植株奠定了基礎(chǔ).

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