王 卓，井昶雯，曹海霞，馬 蓉，吳建中

肺癌是導(dǎo)致死亡的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的75 %～85 %，近年來表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR) 突變與腫瘤發(fā)生以及在非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療中的作用日益受到人們的關(guān)注。EGFR 突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶(tyrosine kinase, TK)區(qū)域的前四個(gè)外顯子上(18～21)。EGFR 突變是癌癥患者是否對(duì)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)敏感的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子[1]，因此，EGFR 基因突變的檢測(cè)能為腫瘤靶向治療提供重要依據(jù)。本研究擬采用高分辨率熔解曲線(high resolution melting，HRM)分析技術(shù)建立EGFR 基因突變的檢測(cè)方法，檢測(cè)EGFR 基因18～21外顯子的突變，將其應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)，并評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用價(jià)值 。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本

2010年1月至2012年12月，我院收治的非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤石蠟包埋組織200例。用DNA FFPE tissue kit (Qiagen)提取試劑盒提取石蠟組織DNA，并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 設(shè)計(jì)適用于HRM技術(shù)的引物[2]，引物如表1所示。

表1 HRM法引物

1.2.2 HRM反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

HRM檢測(cè)采用Roche Light Cycler 480 system。反應(yīng)體系為L(zhǎng)ight Cycler HRM Master Reaction Mix,3 mM MgCl2, and 200 nM primers和DNA模板，總體積為20 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性10 s，65 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45個(gè)循環(huán)(采用touchdown技術(shù)，前10個(gè)循環(huán)退火溫度從65 ℃降到55 ℃，每個(gè)循環(huán)降1 ℃)。擴(kuò)增結(jié)束后直接進(jìn)行HRM分析，反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從70 ℃到95 ℃，溫度上升速率為1 ℃/s。40 ℃冷卻。

1.2.3 所有實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本HRM法檢測(cè)結(jié)果均與金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。分析其特異性和敏感性。測(cè)序法引物如表2所示。

表2 測(cè)序法引物

1.2.4 HRM檢測(cè)體系的重復(fù)性

取經(jīng)測(cè)序法驗(yàn)證的野生型和突變型標(biāo)本各1份，進(jìn)行HRM檢測(cè)。每份標(biāo)本檢測(cè)重復(fù)3次，計(jì)算不同基因型標(biāo)本的Tm 與ct值的CV值。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序法和HRM法EGFR基因突變結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果顯示，EGFR基因18～21外顯子突變總檢出率為37.0%，18～21外顯子突變檢出例數(shù)分別為2，35，2和37例，其中有2例雙突變，均為19，21外顯子雙突變。HRM法檢測(cè)結(jié)果，EGFR基因18～21外顯子突變總檢出率為40.0%，18～21外顯子突變檢出例數(shù)分別為2，39，3和38例，其中有2例雙突變，均為19，21外顯子雙突變，突變樣本與測(cè)序法檢出結(jié)果一致。HRM法突變檢出率略高于測(cè)序法。具體結(jié)果如表3所示。

表3 測(cè)序法和HRM法EGFR基因突變統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖1為實(shí)驗(yàn)中選取的HRM法與測(cè)序法典型突變示意圖。左側(cè)從上到下依次為HRM法檢測(cè)18，19，20和21外顯子的突變示意圖，右側(cè)從上到下依次為測(cè)序法18外顯子G2156C點(diǎn)突變，19外顯子缺失突變，20外顯子插入突變，21外顯子C2573和T2573G突變示意圖。

圖1 HRM法與測(cè)序法典型突變示意圖

2.2 HRM法特異性和敏感性

HRM法與測(cè)序法相比，敏感性與特異性結(jié)果如表4所示。HRM法與測(cè)序法相比，敏感性為100%，特異性為>95%。其敏感性和特異性符合臨床檢測(cè)的要求。

表4 HRM法特異性和敏感性

2.3 重復(fù)性評(píng)價(jià)

野生型和突變型標(biāo)本經(jīng)HRM方法檢測(cè)后，其Tm的CV值分別為0.02%和0.03%。ct值的CV值分別為1.82%和1.56%。CV值均較小，可見該方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。

3 討論

表皮生長(zhǎng)因子受體是一種跨膜蛋白，它的結(jié)構(gòu)主要有3個(gè)部分：細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶域、跨膜區(qū)以及細(xì)胞外的配體結(jié)合域。其主要分布在細(xì)胞膜的表面[3]，屬于HER家族的一員。研究表明其主要作用機(jī)制使其是通過與胞外配體的結(jié)合，然后進(jìn)行同源二聚化或異源二聚化，使得胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，活化的受體募集信號(hào)復(fù)合體并同時(shí)活化下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)化、血管生成以及轉(zhuǎn)移[4-6]。大量資料表明EGFR基因是肺癌生長(zhǎng)相關(guān)的重要調(diào)控基因[5-6]。EGFR突變主要發(fā)生在胞內(nèi)TK區(qū)域的前四個(gè)外顯子上(18～21)，他們能導(dǎo)致不依賴于配體的EGFR TK激活。EGFR突變是癌癥患者是否對(duì)TKI敏感的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子[1],因此，EGFR基因突變的檢測(cè)能為腫瘤尤其是非小細(xì)胞肺癌患者靶向治療提供重要依據(jù)。

目前臨床上進(jìn)行EGFR基因突變的檢測(cè)多采用測(cè)序法和ARMS法。測(cè)序法過程較復(fù)雜繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，且該方法對(duì)取材和操作技術(shù)的要求比較高，此外由于測(cè)序方法本身的限制靈敏度不高，原則上只能對(duì)含量大于30%的突變基因進(jìn)行檢測(cè)，致使很多標(biāo)本的檢測(cè)受限。ARMS法方便、靈敏，但價(jià)格昂貴，且只能檢測(cè)已知突變，無法檢測(cè)未知突變。因此，尋找并建立新的EGFR基因突變的臨床檢測(cè)方法顯得極為重要。

HRM法的原理是在擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的基因的過程中,由于基因突變位點(diǎn)的不匹配會(huì)導(dǎo)致在升溫過程中其雙鏈DNA率先解開,從而使得熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放出來，因此，從時(shí)間曲線和熒光強(qiáng)度上就可以判別出是否存在突變位點(diǎn)[7-10]。雖然HRM法無法像測(cè)序法那樣準(zhǔn)確檢測(cè)出具體突變類型，但是不同基因突變的位點(diǎn)、純合子還是雜合子等因素都會(huì)影響熔解曲線的峰形，因此，HRM檢測(cè)分析能夠區(qū)分出不同的基因類型和不同基因突變的位點(diǎn)[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，HRM法檢測(cè)突變的靈敏度達(dá)到5%[2]，與測(cè)序法相比靈敏很多，因此HRM法突變檢出率理論上應(yīng)高于測(cè)序法。本文的研究結(jié)果也顯示HRM法突變檢出率略高于測(cè)序法。但高出的突變檢出率是由于檢測(cè)靈敏度的提高，還是因檢測(cè)中存在假陽性，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，尤其是臨床療效的觀察驗(yàn)證。

總之，本文的初步研究可以看出，HRM法與測(cè)序法和ARMS法相比較，具高通量，敏感性和特異性好，重復(fù)性好，不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，可以檢測(cè)未知突變，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行HRM分析，操作簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間，成本低，適合應(yīng)用于臨床檢測(cè)EGFR基因突變。

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