冒韻東

（南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院／江蘇省人民醫(yī)院／江蘇省婦幼保健院臨床生殖醫(yī)學科；生殖醫(yī)學國家重點實驗室，南京 210029）

作為不孕癥治療的重大突破，三十多年來體外受精-胚胎移植（IVF-ET）已成為重要的臨床治療手段，而IVF-ET 中重要的基礎——超促排卵也成為臨床醫(yī)生特別關注的實踐與研究課題。IVF中促排卵是否必要？如何促排卵？促排卵方案中降調(diào)節(jié)與非降調(diào)節(jié)孰優(yōu)孰劣？促排中卵母細胞數(shù)量與卵母細胞質(zhì)量誰更重要？是卵母細胞的數(shù)量還是質(zhì)量對助孕的結局影響更大？

隨著發(fā)育和細胞生物學認識的深入，我們了解到體細胞（顆粒細胞／卵泡膜細胞）功能-卵發(fā)育相互作用、卵泡的生理組學效應、自然周期中卵泡的生命周期、卵巢局部旁分泌／自分泌作用、內(nèi)分泌的作用等均可影響卵母細胞質(zhì)量。其中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β超家族成員，如抑制素（Inhibin）、激活素（Activin）、卵泡抑素（Follistatin）、骨形態(tài)形成蛋白（BMP）、生 長 分 化 因 子（GDF）、抗 苗 勒 氏 管 激 素（AMH）等均屬生長因子，可通過卵巢旁分泌和／或自分泌調(diào)控卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟。其它涉及卵巢旁分泌／自分泌的因子還有表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（FGFs）家族、胰島素樣生長因子（IGFs）家族、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族、細胞因子（cytokin）家族、白細胞介素（interleukins）、腫瘤壞死因子（TNF）-α等。

基于已有的相關知識，靈活應用促性腺激素中卵泡刺激素（FSH）和黃體生成素（LH）或絨毛膜促性腺激素（HCG），根據(jù)患者不同的反應性設計個體化促排卵方案以獲得更好的臨床結局是我們追求的永恒主題。為達到這一目的，本文就目前的國際國內(nèi)最新研究成果，對卵巢旁分泌／自分泌在卵泡發(fā)育中的作用及促排卵中，特別是降調(diào)節(jié)方案中促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a）和拮抗劑（GnRH-ant）對卵巢旁／自分泌的影響加以綜述。

一、與卵泡發(fā)育相關的卵巢旁／自分泌

1.促性腺激素作用前的卵泡生成：生長卵泡的激活表現(xiàn)為休眠狀況的原始卵泡轉(zhuǎn)化為卵泡，即卵母細胞增大，周圍環(huán)繞單層顆粒細胞和一層外基底膜。有證據(jù)表明激活不依賴FSH，在沒有促性腺激素時激活仍可繼續(xù)發(fā)生，行垂體切除的嚙齒類［1］及敲除FSHb（編碼FSH-b 亞單位）及FSHr（編碼FSH 受體）基因的動物［2-4］仍可維持這種激活能力。

自出生至絕經(jīng)，所有的卵泡儲備都將不斷地被激活［5］。卵母細胞與周圍的體細胞通過旁分泌的相互交流即是對卵泡激活的反應。參與旁分泌的體細胞因子包括KIT 配體，通過卵表達KIT 配體刺激卵母細胞生長及存活［6］。相反，源于卵母細胞的旁分泌因子則參與顆粒細胞的形成和分裂［7-9］，這些因子包括GDF-9和BMP15。叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box transcription factors）的FOXO 超家族成員可以抑制休眠期原始卵泡的激活，這是通過抑制PI3K／Akt信號通路實現(xiàn)的［10-11］。對該信號通路的去抑制（如通過KIT）則使卵泡激活［6］。

初級卵泡（單層顆粒細胞）發(fā)育至次級卵泡（竇前）階段需卵母細胞的進一步增大，顆粒細胞增生且被對LH 敏感的卵泡膜細胞層包圍。該過程不依賴FSH 但完全依賴于TGF-β超家族成員的旁分泌信號。在初級-次級卵泡中，AMH［12］和激活素亞單位基因（INHBA、INHBB）表達占優(yōu)勢［13］。在卵泡成熟晚期，inhibin-a亞單位表達增加，inhibin-A 異二聚 體 （INHA／INHBA）和 inhibin-B （INHA：INHBB）形成均增加［8-9］。有排卵前卵泡自卵泡隊列中被選出的標志就是inhibin-B的產(chǎn)生，而排卵前卵泡自身主要產(chǎn)生inhibin-A［14-15］。AMH 二聚體可抑制早期卵泡的生長及在體外對FSH 的反應性，故其發(fā)揮著控制卵泡轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)育為排卵前卵泡能力 的 作 用［12］。Activin（INHBA 和INHBB 的 同 二聚體或異二聚體）可促進顆粒細胞增生，促進其對FSH 的反應性并抑制卵泡膜細胞的雄激素合成。Inhibin類可促進LH 刺激雄激素合成并提供主要的卵泡內(nèi)的雄激素合成［13］。

2.依賴促性激素的卵泡生長：卵泡腔的形成和竇卵泡擴張絕對依賴FSH［16-17］。早期竇卵泡（≤5mm）的正常發(fā)育早在嬰兒期就存在，但發(fā)育至排卵前卵泡（≥20mm）的生長依賴于成人的FSH 水平并可形成有排卵的月經(jīng)周期。

在依賴FSH 的卵泡發(fā)育過程中，由自分泌和旁分泌所產(chǎn)生的Activin 類和Inhibin 類的作用機制正好相反。未成熟竇卵泡產(chǎn)生的Activin類可以增加顆粒細胞對FSH 的敏感性和反應性，同時抑制對LH 反應的卵泡膜細胞的雄激素合成。適當FSH刺激可使卵泡轉(zhuǎn)而形成Inhibin類，從而促進雄激素的合成。雄激素又轉(zhuǎn)而增加FSH 對Inhibin類合成的促進作用。維持雄激素的合成需要LH，沒有雄激素的合成就沒有雌激素的合成。排卵前卵泡的成熟也需要LH，以產(chǎn)生具有完全受精能力的卵［13，18］。除主要受關注的TGF-β超家族成員，還有許多其它多肽生長因子參與卵泡內(nèi)的旁分泌信號通路，其中IGF 起到了部分重要的促性腺激素作用前的作用［19］。

3.早卵泡期：月經(jīng)周期開始時，周期性的FSH升高募集中間成熟卵泡（2～5 mm 直徑）進入排卵前卵泡發(fā)育的初始階段。此時存在一個FSH 的敏感范圍，而占據(jù)此隊列的卵泡都有其自身的“閾值”，需要FSH 的進一步刺激才能繼續(xù)發(fā)育［20-22］。旁分泌和自分泌信號可完整地建立各個不同的FSH 閾值需求，而其差異可小至10%～30%。只有具有最低FSH 閾值的卵泡最可能被選出并最終排卵。

4.晚卵泡期：在一批被募集卵泡中一般只有一個卵泡因FSH 的作用而發(fā)育為排卵前卵泡并最終排卵。這個“優(yōu)勢”卵泡可以發(fā)育并接受中-晚卵泡期不斷下降的FSH 的作用，因為有直接的、持續(xù)的FSH 刺激，優(yōu)勢卵泡的顆粒細胞不僅對FSH 敏感，而且也表達LH 受體（LHR），故除對FSH 反應外同時也直接對LH 產(chǎn)生反應［23-24］。在其成熟的最后一周，排卵前卵泡產(chǎn)生的雌激素明顯增加，主要依賴內(nèi)分泌（LH）和旁分泌（inhibin-A）信號通路的作用［13］。卵和卵丘細胞的LH 依賴階段仍然非常依賴旁分泌信號，如GDF9 和BMP15［25］。就像生長因子（見前述各類生長因子）和EGF 受體的反式激活的信號必需LH 一樣，EGF也在LH 的誘發(fā)下最終引起排卵［26］。排卵前卵母細胞的減數(shù)分裂的恢復是通過一種分子去抑制機制，即由LH 誘導第二信使cAMP撤退或失活［27］。

二、促性腺激素調(diào)控卵巢旁分泌信號

旁分泌信號可以解釋為何促性腺激素對于卵功能具有潛在益處，也可以理解為何不恰當?shù)膽猛庠葱源傩韵偌に乜赡軒淼暮μ帲?8］。卵母細胞本身并不具有有功能的促性腺激素受體，但依賴于卵泡內(nèi)的體細胞，可通過卵丘來源的微絨毛傳遞促性腺激素的作用，該作用通過透明帶傳入卵細胞漿［7］。由卵泡膜細胞產(chǎn)生的低分子量分子經(jīng)基底層擴散入壁顆粒細胞。這些顆粒細胞自身及與卵丘間通過縫隙連接相互連接，這些連接由FSH 刺激而形成。LH 刺激的旁分泌信號也可以影響卵母細胞，即使在平時卵泡內(nèi)這些顆粒細胞并不表達LH 受體（LHR）。然而，顆粒細胞也一過性的需要LHR 對FSH 產(chǎn)生反應，通過LH 刺激壁及卵丘顆粒細胞，使得直接將旁分泌信號傳至卵母細胞成為可能，這即是自發(fā)性LH 峰或注射HCG 使排卵前的卵母細胞恢復減數(shù)分裂的可能機制。縫隙連接也可以連接卵丘和卵母細胞，它們之間的聯(lián)系的關閉是由于Erk1／Erk2介導的磷酸化，這也可能是LH 峰重啟減數(shù)分裂和卵母細胞在排卵時成熟的部分機制［29］。

盡管用促性腺激素促排卵有明顯益處，即獲得更多的卵母細胞，但也可損害卵母細胞質(zhì)量使其染色體異常，并在著床前發(fā)育過程中干擾印跡［30-31］。對患者而言“超排卵”花費較大，耗時且由于卵巢過度刺激綜合征（OHSS）等并發(fā)癥有潛在的健康風險，而長期的健康風險還包括卵巢癌［32］。因此，讓業(yè)內(nèi)人士更感興趣的是應用更加溫和的促排方案，即更好地模仿生理狀況和強調(diào)卵母細胞的質(zhì)量而不是數(shù)量。為實現(xiàn)此目標，更有效的控制性促排卵（COS）不應背離自然周期中卵泡的生命周期特征，故自然周期IVF可能是我們最終追求的目標。

三、GnRH-a／ant與卵巢旁／自分泌

在常規(guī)的促超排卵方案中離不開GnRH-a和GnRH-ant的應用，降調(diào)節(jié)是否會影響卵泡的發(fā)育與卵母細胞質(zhì)量？有研究發(fā)現(xiàn)GnRH-ant方案組／GnRH-a長方案組兩組中IGF 系統(tǒng)，如IGF-II、IGF結合蛋白-4（IGFBP-4）濃度和IGF-I／IGFBP-4比值明顯不同，而兩組間每成熟卵泡的血清E2水平及妊娠相關血漿蛋白（PAPP）-A 的濃度沒有差異，與GnRH-ant方案組比較，GnRH-a長方案組的較高IGF-II濃度的作用可被同樣較高濃度的IGFBP-4所抑制［33］。Dong等［34］的研究中發(fā)現(xiàn)GnRH-ant方案組的AMH mRNA 和蛋白表達均被降調(diào)，而干細胞因子（SCF）mRNA 和蛋白的表達則被升調(diào)，這些作用是劑量依賴性的，在GnRH-ant濃度較高的組（10-7mol／L）差異有統(tǒng)計學意義。如果聯(lián)合應用GnRH-a和GnRH-ant，兩者相反的作用將其各自的作用消除。基于這些結果，他們認為，GnRH-a和GnRH-ant對于自分泌／旁分泌因子AMH 和SCF的作用是不同的，同時可以部分解釋GnRH-a 和GnRH-ant在卵巢儲備方面的不同效應。

GnRH 可以刺激人類顆粒黃體細胞有絲分裂原激活蛋白激酶，也可作為一種自分泌因子［35-36］。GnRH 受體也在一些垂體以外的組織表達，其中包括卵巢、子宮和胎盤［37-38］。有一些研究發(fā)現(xiàn)，可以在 人卵 巢 中 檢 出GnRH 受 體mRNA［37，39-40］。對 于GnRH 受體mRNA 調(diào)節(jié)的研究發(fā)現(xiàn)，GnRH 可以上調(diào)而HCG 則降調(diào)GnRH 受體及其基因表達［39］。Brus等［41］等認為LH 峰后卵巢組織中GnRH 受體占主導地位，但在排卵前卵泡中并未檢測出GnRH受體。雖不清楚GnRH 受體在人卵巢中是否具有功能，但GnRH-ant 可能干擾了人卵巢細胞內(nèi)GnRH的自／旁分泌信號，改變了卵泡內(nèi)的微環(huán)境，這可以部分解釋為何GnRH-ant方案的控制性促排卵（COS）和IVF-ET 結果與GnRH-a方案的結果不同。在體外實驗中，GnRH-ant可通過降低IGF 合成和IGF 的生長刺激作用而抑制細胞生長［42］。GnRH-ant干擾生殖系統(tǒng)組織細胞中的GnRH 的自／旁分泌信號是可能的，如果GnRH-ant可抑制IGF，那么GnRH-ant對IGF 的直接抑制即可影響卵泡生成、著床和胚胎發(fā)育。

Hsueh等［43］發(fā)現(xiàn)GnRH-a的垂體外活性為抗顆粒細胞分化，抑制卵巢內(nèi)甾體激素的合成，而GnRH-ant則可能緩解卵巢內(nèi)對卵泡生長的抑制，從而引起性早熟。在卵巢內(nèi)，GnRH-a和GnRH-ant的作用是不同的；GnRH-a和GnRH-ant對垂體促性腺激素的作用與其在卵巢內(nèi)對GnRH 系統(tǒng)的作用也是完全不同的［44］。GnRH-a和GnRH-ant在卵巢內(nèi)對生長因子的影響至少部分反映在卵泡生成方面，其具體作用機制目前尚不明確。據(jù)報道，在實驗條件下，高濃度西曲瑞克（cetrorelix）對于生長因子，如表皮生長因子（EGF）、IGF-I和IGF-II及其受體均有抑制作用［45］。相反，Weiss等［46］的研究是有關源自不同助孕治療方案的人類顆粒細胞中GnRH-ant對IGF-II、IGFBP-2和PAPP-A 的作用，他們認為GnRH-ant不會影響顆粒黃體細胞的IGF系統(tǒng)。

在中樞和外周已發(fā)現(xiàn)兩種 GnRH 受體（GnRHR），為GnRHR-I 和GnRHR-II，隸 屬 于G-蛋白偶聯(lián)受體超家族（G prtein-coupled receptor superfamily，GPCR）［47-48］。GnRHR-I 被 認 為 與 多個G 蛋白亞單位（Gqα，Gsα和Giα）偶聯(lián)并作用于多個信號通路［49-51］。越來越多的證據(jù)表明，多個G 蛋白有介導GnRHR-I作用提高的效應，同樣也有對GPCR 的調(diào)節(jié)作用，這是通過一些不同的組織或細胞的不同信號轉(zhuǎn)導通路實現(xiàn)的［52-53］。研究發(fā)現(xiàn)，在垂體和卵巢中GnRH 的結合位點均可被GnRH 升調(diào) 和 降 調(diào)［54，55］。Dong 等［34］認 為，通 常 低 劑 量GnRH或脈沖給藥可升調(diào)該受體，而大劑量GnRH或連續(xù)給藥可降調(diào)該受體數(shù)目，基于該結果，推測GnRH-a和GnRH-ant 對于自分泌／旁分泌因子AMH 和SCF 的 作 用 不 同。AMH 和SCF 的 差 異表達可能是由GnRHR-I介導的；大劑量治療可下調(diào)卵巢內(nèi)受體的數(shù)量。另一個可能的解釋是：GnRHR的調(diào)節(jié)可能通過偶聯(lián)不同的G 蛋白亞單位并激活相應的信號通路。

綜上所述，隨著卵巢內(nèi)旁／自分泌的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其涉及多種因子并在卵泡發(fā)育的各個階段起作用，外源性應用FSH／LH 有可能與卵巢內(nèi)旁／自分泌相互影響從而影響卵質(zhì)量。GnRH-a／GnRH-ant除中樞作用外也在外周，如卵巢發(fā)揮旁／自分泌因子的作用。GnRH-a／ant降調(diào)可能影響卵巢旁分泌／自分泌，從而影響卵泡生成／卵母細胞質(zhì)量／著床／胚胎發(fā)育，需進一步研究揭示其機制。接近自然的助孕方案應是我們不懈追求的目標。

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