劉 濤，侯彥強

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院松江分院，上海201600)

胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)是Bertin等［1］在對CARD研究時發(fā)現(xiàn)的一個重要銜接蛋白，通過蛋白間的相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。CARD9定位于染色體9q34.3，CARD9cDNA 全長2 108 bp，編碼536個氨基酸殘基，產(chǎn)生相對分子質(zhì)量為62.3 kD的蛋白質(zhì)。CARD9包含一個具有胱天蛋白酶募集功能的N末端區(qū)域和一個具有寡聚化作用的卷曲螺旋C末端區(qū)，通過CARD-CARD相互作用與B細(xì)胞淋巴瘤10(Bcl 10)相連，而Bcl 10直接與黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1(MALT 1)連接激活細(xì)胞。在炎癥反應(yīng)中，CARD9與Bcl 10和MALT 1形成CBM復(fù)合體，連接模式識別受體(PRRs)。CARD9能夠識別細(xì)菌、真菌和病毒，也能夠識別內(nèi)源性危險信號。在宿主的防護(hù)方面，CARD9在炎癥信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，CARD9的多態(tài)性與人類的炎癥性疾病也有著緊密關(guān)系?，F(xiàn)將CARD9在炎癥信號通路中的作用研究進(jìn)展綜述如下。

1 CARD9對上游和下游信號的調(diào)節(jié)作用

先天免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，表達(dá)著不同種系編碼的PRRs。當(dāng)細(xì)胞受損后，面對感染和內(nèi)源性危險信號時，這些PRRs能夠識別微生物中普遍存在的高度保守的共有結(jié)構(gòu)即病原體相關(guān)分子模式［2］。PRRs包括 Toll樣受體(TLRs)、核苷酸寡聚化區(qū)樣受體(NLRs)、RIG-I樣受體(RLRs)以及樹突狀細(xì)胞相關(guān)的C型凝集素受體(CLRs)等。受體偶聯(lián)之后，PRRs就會啟動細(xì)胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)，進(jìn)行信息整合和介導(dǎo)免疫反應(yīng)。CARD9就是一種能夠銜接這些信號的關(guān)鍵蛋白。

1.1 CARD9 對 Dectin-1、Dectin-2 等上游信號的調(diào)節(jié) Dectin-1作為CLRs家族中的一員，其ITAM結(jié)構(gòu)域在配體激活Dectin-1的情況下直接招募Syk并使之活化，在抗真菌免疫領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。Dectin-1-Syk信號通路可以識別真菌，啟動細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)反應(yīng)，介導(dǎo)對真菌的吞噬作用，控制活性氧(ROS)的產(chǎn)生，重構(gòu)炎性細(xì)胞因子和趨化因子基因的表達(dá)。在Dectin-1誘導(dǎo)的NF-кB激活通路中，CARD9敲除的樹突狀細(xì)胞將失去作用。Dectin-1能夠特異識別真菌細(xì)胞壁上的β-葡聚糖連接位點β-1，3和β-1，6。在白色念珠菌和酵母多糖誘發(fā)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生過程中，CARD9敲除的小鼠樹突狀細(xì)胞嚴(yán)重受損，因為β-葡聚糖、凝膠多糖和選擇性Dectin-1激動劑嚴(yán)格按照CARD9依賴的方式在小鼠骨髓細(xì)胞中誘發(fā)炎癥反應(yīng)［3］。Goodridge等［4］研究發(fā)現(xiàn)，CARD9 在 Dectin-1介導(dǎo)的NF-кB激活通路中有著特殊的作用。與髓樣細(xì)胞分化初次應(yīng)答蛋白-88介導(dǎo)的NF-кB激活過程中激活TLRs下游信號不同的是，CARD9介導(dǎo)NF-кB激活的過程中激活Dectin-1的下游信號。

Dectin-2是抗真菌防御系統(tǒng)中CLRs的家族成員之一，能夠給PKCδ-CARD9軸傳遞信號。Dectin-2能夠特異性識別真菌細(xì)胞壁上的α-甘露聚糖，其刺激信號能夠激活依賴Syk-PKCδ-CARD9的NF-кB的活化［5］。受白色念珠菌感染時，CARD9-/-細(xì)胞中炎癥反應(yīng)幾乎全部消失，而在Dectin-1和Dectin-2敲除細(xì)胞中炎癥反應(yīng)只是部分受損。CARD9在PKCδ的作用下磷酸化，從而在Syk信號的介導(dǎo)下通過 CLRs受體 Dectin-1、Dectin-2等使能夠活化NF-кB的CBM復(fù)合物形成。

1.2 CARD9 對 NLRs、RLRs等下游信號的調(diào)節(jié)CARD9不僅在CLRs向下游傳遞信號的過程中扮演著十分重要的角色，也能夠觸發(fā)NLRs或RLRs等對細(xì)胞內(nèi)危險信號的感應(yīng)。

NLRs有三個特殊的結(jié)構(gòu)，包括NOD、C端重復(fù)序列以及一個易變的N末端區(qū)域［6］。NOD1和NOD2能夠識別細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖及其降解產(chǎn)物，通過CARD-CARD相互作用及其受體絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶的相互作用產(chǎn)生交聯(lián)。Hsu等［7］研究表明，連接NOD2到下游信號MAPK的激活(包括p38和JNK)需要CARD9的參與。CARD9可以調(diào)節(jié)NOD2向下游信號的傳導(dǎo)，有利于細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在用胞壁酰二肽或肽聚糖降解產(chǎn)物刺激CARD9-/-小鼠巨噬細(xì)胞后，或在單核細(xì)胞增生性李斯特菌感染細(xì)胞后，由于CARD9的缺失，細(xì)胞因子的合成及p38和JNK的活性將大大降低，而對微生物感染后NF-кB的激活沒有影響。而在野生型細(xì)胞中，單核細(xì)胞增生性李斯特菌感染后，CARD9與NOD2進(jìn)行交聯(lián)，且CARD9與NOD2的過表達(dá)可以協(xié)同作用活化p38和JNK，導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抵御微生物的侵入。這些結(jié)果說明，CARD9能夠選擇性地控制NOD2下游信號p38和JNK的激活，只是CARD9控制這一信號通路的確切分子機制依然尚未闡明。

RLRs家族視黃酸誘導(dǎo)蛋白-I(RIG-I)、黑素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)以及遺傳學(xué)和生理學(xué)實驗室蛋白2能夠識別dsRNA病毒的任意一條RNA基因或ssRNA病毒應(yīng)答介導(dǎo)區(qū)域［8］。RLRs包括一個結(jié)合RNA的解旋酶區(qū)域、一個C末端調(diào)節(jié)區(qū)域以及2個N末端CARDs，與適配線粒體抗病毒信號蛋白相互作用轉(zhuǎn)導(dǎo)信號給IFN調(diào)節(jié)因子和NF-кB調(diào)節(jié)通路。在小鼠中，RIG-I和MDA5誘導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)需要 CARD9-Bcl 10 復(fù)合物來激活 NF-кB［9］。而且，在選擇性 RIG-I配體5'pppRNA的刺激下，在RIG-I活化的水泡性口炎病毒感染時，或腦心肌炎病毒感染后，CARD9-/-和Bcl 10缺乏小鼠的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-1β的量減少。Abdullah等［10］研究說明，除病毒RNA之外，進(jìn)入感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的單核細(xì)胞增生性李斯特菌分泌的細(xì)菌核苷酸在CARD9的參與下能夠誘導(dǎo)依賴RIG-I的IL-1β的產(chǎn)生。說明，CARD9在控制RLRs誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中起著積極的作用。

2 CARD9在宿主防御中的作用

在宿主的防護(hù)方面，活體遺傳研究揭示了CLR在觸發(fā)CARD9信號傳導(dǎo)中有著不可替代的作用。Dectin-1和Dectin-2敲除的小鼠中，其抗白色念珠菌、煙曲霉菌及抗卡氏肺孢子蟲的能力將大大削弱，因為不同的受體對不同真菌的識別不同。Dectin-1功能多態(tài)性缺失的人群更容易受到白色念珠菌的感染和曲霉菌的侵襲，CARD9缺失的小鼠極易受到病原真菌的感染，尤其是白色念珠菌。雖然沒有直接的對照實驗，但許多文獻(xiàn)的報道中都闡明了CARD9-/-小鼠比單獨缺失CLR小鼠更易于感染白色念珠菌。CARD9缺失小鼠對部分細(xì)菌感染的控制受損。肺結(jié)核分支桿菌感染小鼠后，CARD9缺失的小鼠體內(nèi)將會有更多的分枝桿菌感染且伴有致命的炎癥反應(yīng)［11］。在這些小鼠的肺部，中性粒細(xì)胞過渡浸潤，IL-10產(chǎn)生減少。因此，人們推斷CARD9-/-小鼠不能對炎癥反應(yīng)進(jìn)行控制。

人群中，CARD9的缺陷歸結(jié)于點突變，致使CARD9編碼序列中終止密碼子Q295X過早的出現(xiàn)，導(dǎo)致慢性黏膜皮膚念珠菌病形成常染色體隱形遺傳［12］。在對CARD9缺陷小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行的體外重構(gòu)實驗中，相對于完整的CARD9蛋白，CARD9的Q295X突變沒有能夠恢復(fù)CARD9-/-細(xì)胞對Dectin-1信號的傳導(dǎo)，說明Q295X是一種功能缺失突變。與Th-17分化小鼠中CARD9功能表現(xiàn)一致的是，CARD9 Q295X突變的患者體內(nèi)Th-17細(xì)胞減少。近期，Drewniak等［13］發(fā)現(xiàn)，一位腦部感染了白色念珠菌的慢性患者，其CARD9基因中存在雙重雜合子兩種功能突變的缺失。因此，CARD9不僅在黏膜皮膚抗真菌感染中十分重要，在防護(hù)疾病入侵方面也是必不可少的。

3 CARD9的多態(tài)性

雖然在宿主防護(hù)方面必須有先天性免疫的激活，但是異常的先天性免疫反應(yīng)能夠觸發(fā)炎癥性疾病的產(chǎn)生。克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)都是由于固有免疫的失調(diào)和腸道微生物的變化引起的慢性胃腸道紊亂性炎癥［14］。NOD2是第一個用于鑒定CD易感性的基因。Zhernakova等［15］對固有免疫通路候選基因分析發(fā)現(xiàn)，CARD9的多態(tài)性與CD及UC的進(jìn)展之間有一定的關(guān)系。CARD9與腸炎(IBD)之間的關(guān)系很快得到威康信托基金會病例控制協(xié)會CD資料組的確認(rèn)，以及全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWASs)的證明。GWAS基因座的排序揭示，CARD9連接位點的變化僅僅存在于健康組而非IBD患者中，說明CARD9連接位點的變化可能對人們具有保護(hù)效應(yīng)［16］。而且，Cooke 等［17］研究說明，相對于健康組，IBD患者的CARD9基因可能被甲基化了。其他的和IBD有關(guān)的慢性炎癥與CARD9的多態(tài)性之間也有關(guān)聯(lián)，這些紊亂會誘發(fā)原發(fā)性硬化性膽管炎，導(dǎo)致膽管纖維化、膽汁淤積以及強直性脊柱炎等［18，19］。

綜上所述，CARD9在抗真菌、細(xì)菌和病毒等先天性免疫反應(yīng)方面扮演者重要角色。CARD9信號被認(rèn)為是在慢性炎癥反應(yīng)中的媒介物。雖然在炎癥性疾病中，激活CARD9信號通路的配體依然需要闡明，CARD9信號小體的確切細(xì)胞類型和功能依然需要研究，連接CARD9活化的受體近端事件的分子機制以及CARD9模塊向炎癥效應(yīng)器傳遞信號的機制有待進(jìn)一步總結(jié)歸納，但是，隨著人們對CARD9信號通路的深入研究，CARD9信號通路作為藥物作用靶點在炎癥治療中的重要作用將逐漸清晰。未來，CARD9在免疫炎性疾病中的作用將為人類疾病的治療提供新的思路和方法。

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