蘇曉鈺 張穎

（青島市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)技術(shù)研究所，山東青島266000）

探究食品檢驗(yàn)的PCR技術(shù)

蘇曉鈺*張穎

（青島市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)技術(shù)研究所，山東青島266000）

PCR技術(shù)屬于無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)以其特有的功能占據(jù)了廣闊的市場(chǎng)。通過(guò)介紹PCR技術(shù)產(chǎn)生的基本原理，來(lái)探討PCR在判斷食品的轉(zhuǎn)基因性質(zhì)、食品中所含微生物以及鑒定食品原料種類(lèi)等的應(yīng)用情況。

PCR技術(shù)；食品；檢驗(yàn)

PCR技術(shù)是食品檢驗(yàn)中經(jīng)常用到的一種檢測(cè)技術(shù)，在使用的過(guò)程中形成一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，這項(xiàng)技術(shù)早在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)產(chǎn)生。在應(yīng)用了PCR技術(shù)以后，DNA能夠在較短的時(shí)間內(nèi)形成一種快速擴(kuò)張的過(guò)程。由于PCR具有其他技術(shù)不能比擬的高靈敏度、高效快速等特點(diǎn)，所以這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大。

1 PCR技術(shù)的基本原理及檢測(cè)步驟

1.1 PCR技術(shù)的基本原理

PCR技術(shù)就是在已經(jīng)知道需要進(jìn)行擴(kuò)增的DNA片段序列的情況下，利用人工合成的方式，將兩段寡核苷酸作用于需要擴(kuò)增的DNA序列上，并完成擴(kuò)增的過(guò)程。在使用PCR技術(shù)時(shí)，需要使DNA經(jīng)歷高溫、低溫和適溫的反復(fù)作用，最終達(dá)到增加DNA擴(kuò)增的目的。DNA經(jīng)歷高溫變性的過(guò)程主要是將雙鏈模板轉(zhuǎn)化為單鏈模板，低溫退火能夠使DNA與寡聚核苷酸引物進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而形成雙鏈，適溫延伸就是將發(fā)生作用的系統(tǒng)溫度調(diào)節(jié)到適溫，當(dāng)聚合酶與DNA發(fā)生作用，并且有4種核苷酸同時(shí)存在時(shí)，引物鏈就會(huì)和模板形成新鏈，這種新鏈能夠在接下來(lái)的反應(yīng)中繼續(xù)充當(dāng)模板，基因的數(shù)量也會(huì)在這一過(guò)程中得到擴(kuò)增。

1.2 PCR技術(shù)檢測(cè)步驟

一般在利用PCR技術(shù)對(duì)目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，都會(huì)經(jīng)歷以下幾個(gè)步驟：①使用化學(xué)手段來(lái)提取需要檢測(cè)的DNA；②對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的結(jié)果會(huì)直接影響到PCR技術(shù)發(fā)揮作用的程度，一般情況下都會(huì)將引物置于高度保守的區(qū)域，并將其長(zhǎng)度控制在15～30個(gè)堿基以?xún)?nèi)；③開(kāi)展PCR的擴(kuò)增工作；④對(duì)DNA進(jìn)行克隆，并挑選需要進(jìn)行PCR鑒定的目標(biāo)產(chǎn)物，在電泳、染色等作用下，利用紫外線照射的方式來(lái)查看擴(kuò)增的DNA帶，并根據(jù)DNA帶的情況來(lái)鑒定DNA；⑤對(duì)需要檢測(cè)的DNA序列進(jìn)行分析，需要檢驗(yàn)物品中的DNA片段序列、PCR參數(shù)、引物以及退火溫度等。

2 PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品中的應(yīng)用

就現(xiàn)階段基因工程的發(fā)展情況來(lái)看，基因工程不僅促進(jìn)了相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，而且在許多食品檢驗(yàn)領(lǐng)域中，也都起到十分重要的作用。從基因工程應(yīng)用的技術(shù)方面來(lái)看，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用能夠增強(qiáng)食品的口感，也能夠幫助農(nóng)作物改善自身的生長(zhǎng)機(jī)能，并使農(nóng)作物向高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的方向發(fā)展。雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠?yàn)槭称奉I(lǐng)域的發(fā)展提供更多的契機(jī)，但從轉(zhuǎn)基因食品的安全問(wèn)題上來(lái)看，許多國(guó)家都比較重視這一問(wèn)題，國(guó)際上的有些國(guó)家明確指出，轉(zhuǎn)基因食品中的轉(zhuǎn)基因物質(zhì)如果超過(guò)了標(biāo)準(zhǔn)定量，就需要在食品標(biāo)簽上詳細(xì)注明，并且還有些國(guó)家嚴(yán)禁出售轉(zhuǎn)基因食品。針對(duì)這一國(guó)際化問(wèn)題，世界各國(guó)都在不斷尋求鑒定轉(zhuǎn)基因食品的方法，而PCR檢驗(yàn)技術(shù)的誕生正適應(yīng)了這種需求。

由于食品中各類(lèi)物質(zhì)含量較多，所以在對(duì)其成分進(jìn)行分析時(shí)，會(huì)存在一定的復(fù)雜性。在檢驗(yàn)的過(guò)程中，必須要考慮如何從物品中提取所需檢驗(yàn)的DNA，還應(yīng)該避免出現(xiàn)假陰性或者假陽(yáng)性等結(jié)果的干擾，因此在利用PCR技術(shù)進(jìn)行食品檢驗(yàn)時(shí)，仍然存在較大的難度。在對(duì)檢測(cè)物品進(jìn)行DNA提取時(shí)，如果該DNA發(fā)生降解，就有可能造成檢查結(jié)果的不準(zhǔn)確，進(jìn)而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。針對(duì)這一情況，在檢查過(guò)程中可以使用RSSL來(lái)提取樣品中的DNA，這樣就能使DNA降解酶變性，進(jìn)而避免在檢查結(jié)果中出現(xiàn)假陰性的情況。要想盡量減少出現(xiàn)假陰性結(jié)果的可能性，就需要保證檢驗(yàn)的引物中含有與樣品DNA相對(duì)應(yīng)的序列，并將其作為陽(yáng)性對(duì)照的主要標(biāo)準(zhǔn)，如果在檢查結(jié)果中沒(méi)有這一標(biāo)準(zhǔn)的顯示，則樣品的DNA中就可能存在抑制PCR技術(shù)發(fā)揮擴(kuò)增作用的物質(zhì)。在判斷食品的轉(zhuǎn)基因性質(zhì)時(shí)，必須保證3對(duì)引物所產(chǎn)生的結(jié)果都為陽(yáng)性，這樣才能有效避免檢測(cè)中出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

由于轉(zhuǎn)基因食品一般都會(huì)有具體的含量限制，所以在鑒別轉(zhuǎn)基因食品時(shí)，還需要對(duì)其中的含量進(jìn)行測(cè)定。歐洲國(guó)家大約在20世紀(jì)90年代就利用內(nèi)標(biāo)來(lái)測(cè)定食品內(nèi)的轉(zhuǎn)基因含量，并利用定量競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)來(lái)測(cè)定不同的樣品，通過(guò)試驗(yàn)可以得知，這種方法的準(zhǔn)確率較高，可以用于轉(zhuǎn)基因食品的含量測(cè)定中。

3 利用PCR技術(shù)檢驗(yàn)食品中的微生物

一般的食品在銷(xiāo)售之前都會(huì)經(jīng)歷生產(chǎn)、運(yùn)送等過(guò)程，這時(shí)食品很容易在微生物的影響下而變質(zhì)。所以在食品檢驗(yàn)中，必須要對(duì)食品中的微生物進(jìn)行檢測(cè)。就普通的食品微生物監(jiān)測(cè)手段來(lái)看，這些方法存在一定的復(fù)雜性，并且不能在較短的時(shí)間內(nèi)判斷出結(jié)果，這就會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的延遲。在PCR技術(shù)產(chǎn)生并應(yīng)用以后，人們將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于食品檢測(cè)中，并在檢測(cè)食品微生物方面取得了顯著的效果。例如在啤酒制造業(yè)中，導(dǎo)致啤酒變質(zhì)的主要微生物就是淀粉酵母，這種物質(zhì)類(lèi)似于啤酒酵母，利用常規(guī)的檢測(cè)方法需要幾天的檢測(cè)時(shí)間，而使用PCR技術(shù)進(jìn)行食品檢測(cè)時(shí)，只需要30 h就能夠完成對(duì)啤酒中微生物的分辨。

在食品檢驗(yàn)中，比較重要的項(xiàng)目就是對(duì)水體微生物的檢測(cè)，利用PCR技術(shù)能夠?qū)?duì)大腸桿菌和大腸菌群進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的時(shí)間大約5 h～6 h，這比普通的檢測(cè)方法縮短了48 h左右。

食品中的成分種類(lèi)較多，在檢驗(yàn)的過(guò)程中，還可以利用其他方法進(jìn)行輔助檢驗(yàn)，例如在對(duì)食品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行分離時(shí)，需要使用復(fù)合因子血清的多克隆抗體包被磁性球，并結(jié)合PCR技術(shù)來(lái)對(duì)食品中的李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)。在研究食品中肉毒桿菌問(wèn)題時(shí)，有關(guān)專(zhuān)家根據(jù)肉毒神經(jīng)毒素的基因序列來(lái)研制引物，進(jìn)而在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增毒素的基因，最終可以得出食品中肉毒桿菌的存在情況。

4 PCR技術(shù)在判定食品原料種類(lèi)上的應(yīng)用

對(duì)于同一物種來(lái)說(shuō)，由于其種類(lèi)不同，所以各類(lèi)物種之間的價(jià)格也存在較大的差異。要想實(shí)現(xiàn)對(duì)商品種類(lèi)的判定，避免出現(xiàn)質(zhì)量與價(jià)格不符的情況，就需要對(duì)商家的產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)，以證明其產(chǎn)品與標(biāo)簽中原料標(biāo)識(shí)的一致性，這種檢驗(yàn)方式大多用于國(guó)際貿(mào)易往來(lái)中。要想保護(hù)世界上稀有的物種，避免有些唯利是圖的商家利用這些動(dòng)物來(lái)獲取暴利，就應(yīng)該對(duì)一些存在危害保護(hù)動(dòng)物問(wèn)題的產(chǎn)品進(jìn)行原料種類(lèi)的鑒定。

對(duì)于一般的食品原料來(lái)說(shuō)，通過(guò)對(duì)其外在特點(diǎn)的分析，就能夠做出判斷。但從加工食品的角度來(lái)看，特別是已經(jīng)通過(guò)熱處理之后的食品，更不容易判斷食品原料的種類(lèi)，這時(shí)，就需要通過(guò)其他的檢驗(yàn)手段來(lái)確定食品原料的種類(lèi)。從魚(yú)、肉等產(chǎn)品的了解可以得知，這類(lèi)產(chǎn)品的檢驗(yàn)大多通過(guò)PCR技術(shù)來(lái)完成。有關(guān)專(zhuān)家在在鑒定罐裝金槍魚(yú)時(shí)，研究了一種比較科學(xué)的鑒定方法，對(duì)于這類(lèi)通過(guò)熱加工而產(chǎn)生的魚(yú)、肉類(lèi)產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，一般都會(huì)造成其內(nèi)部的DNA降解，在鑒定過(guò)程中，只能夠檢測(cè)到100 bp的片段，這就嚴(yán)重影響到鑒定工作的開(kāi)展。所以在鑒定時(shí)，一般會(huì)使用PCR技術(shù)，利用細(xì)胞色素b基因的短片段進(jìn)行基因擴(kuò)增，這樣就能在短時(shí)間內(nèi)得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

有關(guān)專(zhuān)家還利用PCR技術(shù)對(duì)牛、雞、羊、豬、馬等肉類(lèi)中提出了DNA樣本，并利用引物來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在經(jīng)歷了35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增階段以后，分別從這些擴(kuò)增物中提取了DNA片段，以及相關(guān)反應(yīng)，并以此為根據(jù)來(lái)判斷肉的種類(lèi)。研究人員利用擴(kuò)增DNA的技術(shù)對(duì)26種肉類(lèi)樣品進(jìn)行了科學(xué)評(píng)價(jià)，這種技術(shù)是在不了解DNA序列的前提下，利用10堿基對(duì)的引物來(lái)進(jìn)行的DNA反應(yīng)，最后根據(jù)PCR產(chǎn)物來(lái)做好分析。由于肉類(lèi)自身?yè)碛歇?dú)特的RAPD指紋，所以在分析的過(guò)程中可以通過(guò)這種指紋來(lái)判斷具體的種類(lèi)。PCR技術(shù)除了應(yīng)用于食品領(lǐng)域以外，還在病菌方面的檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用，這些案例都能體現(xiàn)出PCR技術(shù)靈敏度及準(zhǔn)確度高、特性強(qiáng)等特點(diǎn)。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著人們對(duì)食品關(guān)注度的提高，PCR技術(shù)也已經(jīng)成為食品檢驗(yàn)中必不可少的技術(shù)，在這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展的過(guò)程中，其技術(shù)方式也在不斷完善，這種方法所具有優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)也被人們所熟知。在PCR技術(shù)不斷完善的過(guò)程中，其作用也會(huì)越來(lái)越明顯，并且能夠?yàn)楦鱾€(gè)領(lǐng)域的檢驗(yàn)工作提供更多的便利條件。

［1］卿柳庭，屈小玲.核酸探針和PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2000，21（1）：22-24.

［2］郭新竹，寧正祥.PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用［J］.廣州食品工業(yè)科技，2001，17（2）：60-63.

［3］易序權(quán).在食品檢驗(yàn)中應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)［J］.肉品衛(wèi)生，1997（11）：24-27.

［4］張玉霞，黃鳴.食品檢驗(yàn)中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（5）：958-960.

［5］陳梅香.在食品檢驗(yàn)中應(yīng)用PRC技術(shù)［J］.華章，2012（13）：327.

［6］馬靜，孫祖義，徐國(guó)信.食品檢驗(yàn)技術(shù)分析［J］.中國(guó)科技投資，2013（14）：130.

Probe into the application ofPCR technology in food inspection

SUXiao-yu*ZHANGYing
（Qingdaotestingand research center ofproduct quality，ShangdongQingdao266000，China）

PCR technology belongs to free bacteria cloning technique,which is also known for its unique advantages occupya vast market share.The basic principle ofPCR was summarized in this paper.The PCR applications in GMfood identification，microorganisminspection in food，materials identification were probed.

PCR technology；food；inspection

TS207

A

1673-6044（2014）01-0062-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.01.020

*蘇曉鈺，女，1982年出生，2010年畢業(yè)于黑龍江大學(xué)。

2013-11-12