劉玉 趙建民*王雪梅 劉瑞 李強

綜述與講座

細胞凋亡在激素性股骨頭壞死中的研究進展*

劉玉 趙建民*王雪梅 劉瑞 李強

概述

糖皮質(zhì)激素誘導的股骨頭壞死（Steroid-induced femoral head necrosis,SIFHN）又稱糖皮質(zhì)激素誘導的股骨頭缺血性壞死或股骨頭無菌性壞死，激素導致股骨頭壞死早在20世紀50年代就已經(jīng)確立。據(jù)推測[1]，目前中國股骨頭壞死患者有500～750萬，每年新增病例約7.5～15萬，激素成為我國股骨頭壞死發(fā)病的首要原因。激素誘導的股骨頭壞死嚴重影響患者的生活質(zhì)量和勞動能力，給社會帶來了巨大的負擔，大部分患者最終不得不接受人工關節(jié)置換。如能早期診斷和積極治療后可防止股骨頭塌陷，保護關節(jié)功能，控制和延緩病情發(fā)展，可顯著減少致殘率[2,3]。因而激素性股骨頭壞死發(fā)病機制的研究成為近年來國內(nèi)外學者的研究熱點，但目前仍沒有完全闡明激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制。

過去對糖皮質(zhì)激素誘導的股骨頭壞死的發(fā)病機制有多種學說[4]，主要包括：骨內(nèi)壓增高學說；骨的灌注下降學說；脂肪栓塞學說；高凝狀態(tài)學說等。近年來越來越多國內(nèi)外研究表明糖皮質(zhì)激素誘導股骨頭壞死與骨細胞凋亡密切相關，Hwang Y等[5]通過激素誘導的兔股骨頭壞死動物模型發(fā)現(xiàn)細胞凋亡確實存在于早期激素性股骨頭壞死中，這為治療早期激素性股骨頭壞死尋找新的方法，并為在基因水平上治療股骨頭壞死打下基礎。

細胞凋亡（Apoptosis）又稱程序性細胞死亡（Programmed cell death,PCD）是細胞在一定生理或病理條件下，遵循自身程序結束生命的過程，最后細胞脫落、離體或裂解為若干凋亡小體，被其他細胞吞噬。細胞凋亡在個體發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著必不可少的作用[6]。細胞凋亡是多基因嚴格控制的一個主動過程有復雜的分子生物學機制涉及到一系列的基因激活表達以及調(diào)控等[7]。該過程主要包括以下幾個階段：凋亡的激發(fā)、細胞內(nèi)凋亡信號傳導及調(diào)控、凋亡效應分子激活、蛋白及DNA分子斷裂、細胞死亡。細胞凋亡包括兩條核心途徑：外源性途徑和內(nèi)源性途徑。

骨細胞是一種生命周期較長的細胞。骨細胞埋藏在骨基質(zhì)的陷窩中，相鄰的骨細胞彼此聯(lián)系，其特征是胞漿突起通過骨小管伸展到骨基質(zhì)中，并通過臨近骨表面骨細胞的胞漿突起及骨小管，使骨細胞與骨表面細胞相聯(lián)系。因此骨細胞通過細胞突起及其間的縫隙連接形成一個廣泛的細胞通訊網(wǎng)絡，通過感應骨組織的微小損傷和機械應力來完成修復反應，包括代償性的骨增加或減少。另外通過破骨細胞吸收老化或損傷的細胞，并為成骨細胞產(chǎn)生新骨留下一定的空間。正常骨通過以上兩套系統(tǒng)完成其正常的功能，力學信號的感受、分子信息的傳遞及骨的修復重建，一般不會看到骨細胞凋亡。

1 激素導致骨細胞凋亡

激素可導致股骨頭壞死早已確立，很多學者對其進行了研究，報道常用的激素包括甲潑尼龍琥珀酸鈉（簡稱甲強龍）、醋酸潑尼松龍注射液（簡稱潑尼松）。給藥途徑均為臀肌注射，用量不等，常見用量為20mg/kg或7.5mg/kg，2次/周。骨壞死的后期由于股骨頭血管功能不良從而導致了骨細胞發(fā)生凋亡。其中Youm Y S等研究發(fā)現(xiàn)[8]使用大劑量糖皮質(zhì)激素誘導的骨細胞和成骨細胞凋亡增加，由于凋亡的骨細胞和成骨細胞減少了骨的積累，影響骨的重建和修復，大量凋亡細胞的聚集和骨局部不可修復的缺損將破壞骨細胞間信息和能量的傳遞網(wǎng)絡，使骨細胞的應力敏感性下降，導致骨小梁在負重區(qū)斷裂，最后導致微骨折和股骨頭的塌陷。Kerachian等[9]研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡在骨組織累積導致股骨頭發(fā)生壞死、塌陷，隨著骨細胞凋亡的不斷蓄積，在發(fā)生骨質(zhì)疏松之前就可導致骨壞死的發(fā)生。Weinstein等[10]在激素性股骨頭壞死軟骨下半月征區(qū)域發(fā)現(xiàn)豐富的凋亡骨細胞，同時還發(fā)現(xiàn)在激素性股骨頭壞死早期，并沒有發(fā)生以壞死為特征的細胞腫脹及炎性反應。細胞的凋亡可能是骨組織細胞死亡的機制之一。同樣Eberhardt等[11]指出大劑量激素可引起骨細胞的活性改變，凋亡是激素性骨壞死的首要變化。當骨細胞凋亡廣泛發(fā)生時，雖然供應股骨頭的血管尚無明顯變化，但是骨壞死已經(jīng)發(fā)生。Rojas[12]對患者在器官移植激素治療前后進行了骨組織活檢，發(fā)現(xiàn)在使用激素前無成骨細胞的凋亡，在使用激素后有大量成骨細胞凋亡。不僅正常成骨細胞由于使用激素而明顯減少，且未凋亡的骨細胞大多數(shù)由有活性狀態(tài)轉(zhuǎn)入無活性狀態(tài)，血磷的水平也隨之下降，并隨著激素劑量增加變化更加明顯。

2 骨細胞凋亡相關因子及基因

眾多學者通過激素誘導的股骨頭壞死動物模型，研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡確實存在于激素性股骨頭壞死中，這為治療激素性股骨頭壞死尋找新的方法，并為在基因水平上治療股骨頭壞死打下基礎。細胞凋亡是受基因調(diào)控的精確過程，通過內(nèi)源性和外源性兩條途徑發(fā)揮作用。

2.1 Fas及FasL

Fas及其配體FasL是近年來研究得最為深入的有關細胞凋亡的膜表面分子，F(xiàn)as屬于腫瘤壞死因子受體Ⅰ型跨膜蛋白分子，在許多細胞膜上有表達。作為細胞膜表面的受體蛋白，它含有與細胞凋亡信號傳遞密切相關的區(qū)域（死亡結構區(qū)域）。Fas配體（FasL）是Ⅱ型膜蛋白，屬腫瘤壞死家族成員，主要在活化T細胞膜上表達。Kogianni等[13]研究發(fā)現(xiàn)，激素誘導的骨細胞凋亡與Fas/FasL凋亡途徑有關。

2.2 Caspase家族

Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，每Caspase都富含半胱氨酸，它們被激活后，能夠在靶蛋白的特異天冬氨酸殘基部位進行切割，從而使細胞不可逆地走向凋亡。Caspase家族是細胞凋亡的重要執(zhí)行者，Liu等[14]發(fā)現(xiàn)，Caspase-3的活性在細胞凋亡過程中顯著升高，這說明激素誘導成骨樣細胞凋亡是依賴Caspase-3的。梁博偉等[15]發(fā)現(xiàn)激素股骨頭壞死模型中骨細胞膜聯(lián)蛋白A1的表達下調(diào)，而膜聯(lián)蛋白A1表達下調(diào)可激活Caspase3進而引起細胞凋亡。

2.3 Bcl-2家族

Bcl-2是細胞凋亡相關基因中研究最多的家族，抑制凋亡的基因有Bcl-2、Bcl-XL等，促進凋亡的基因有Bax、Bad、Bak等。許多學者發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因與激素有關，Bcl-2蛋白通過阻斷細胞凋亡信號傳遞系統(tǒng)的最后共同通道而抑制細胞凋亡，從而促進細胞成活，成為重要的細胞生成基因。MoriishiT等[16]在特定的成骨細胞Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)性類固醇激素缺乏和糖皮質(zhì)激素過多，可以造成骨細胞凋亡。

2.4 p53基因

P53基因是一種抑癌基因，其生物學功能是在G1和G2/ M期監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細胞增殖，直至DNA修復完成，如果DNA不能被修復，則誘導其凋亡。而且p53基因可通過上調(diào)C-myc、ICE、Fas抗原、bax基因，下調(diào)bcl-2基因，升高細胞內(nèi)Ca2+濃度，誘發(fā)細胞凋亡。Ookawa等[17]研究發(fā)現(xiàn)p53的表達可導致大量細胞停滯在細胞分化周期的G0、G1和G2階段，由此表明p53基因的表達可誘導成骨細胞凋亡。

還有一些其他的相關基因與因子，例如：O′Brien等[18]在鼠的基因中插入能使激素失活的基因來研究激素對骨細胞凋亡的潛在作用時發(fā)現(xiàn)，激素能夠直接作用于成骨細胞和骨細胞，并刺激其凋亡，但是破骨細胞未受影響，從而使骨量減少。此外，Moraes等[19]研究發(fā)現(xiàn)激素能與骨細胞、成骨細胞及破骨細胞表面的受體結合，引起構象變化，影響核內(nèi)某些基因的轉(zhuǎn)錄及表達。同時其他研究者發(fā)現(xiàn)11-HSD2轉(zhuǎn)基因的小鼠就能有效減少激素引起的骨細胞凋亡。還有學者表明，糖皮質(zhì)激素通過激活糖原合酶激酶3（GSK3）誘導成骨細胞凋亡，而應用GSK3抑制劑LiCl后，成骨細胞凋亡減少[20]。

3 骨細胞凋亡的實驗室常見檢測方法

骨細胞凋亡的生理生化過程十分復雜，細胞凋亡檢測對于基礎研究和臨床診斷具有重要意義。目前用于體外細胞凋亡檢測的方法很多，但每種方法都有自身的局限性。骨細胞不同于軟組織細胞或者體外培養(yǎng)細胞，對其的檢測有一定特殊性。例如，流式細胞術檢測骨細胞凋亡較為困難，國內(nèi)尚無用此方法檢測的報道。進行細胞凋亡檢測時，可以選擇合適的方法或多種方法同時進行檢測。

3.1 形態(tài)學觀察

形態(tài)學觀察是常用的一種通過對樣本進行各種染色，應用光學或電子顯微鏡直觀的對凋亡細胞進行觀察。但只能定性，不能定量。

3.1.1 光學顯微鏡檢測

細胞涂片或組織切片經(jīng)固定染色后，就可用光學顯微鏡進行觀察。通常用的染色方法有蘇木精-伊紅染色法、甲基綠-派若寧染色法、Giemsa染色法等。蘇木精-伊紅染色后，細胞質(zhì)呈淡紅色，細胞核呈藍黑色，凋亡細胞的細胞核濃縮、染色致密。但需要鑒別的壞死組織呈均質(zhì)紅染，且結構分不清。甲基綠-派若寧染色后，凋亡細胞細胞核呈綠色，胞質(zhì)呈紅紫色。Giemsa染色后有凋亡小體產(chǎn)生。但由于凋亡細胞大多發(fā)生超微結構的形態(tài)學改變，而普通光學顯微鏡只能觀察到胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體，故利用光鏡常常不令人滿意。

3.1.2 電子顯微鏡檢測

可以觀察到細胞結構在凋亡不同時期的變化，因此電鏡下觀察凋亡細胞的超微結構改變，被認為是鑒定細胞凋亡的金標準[21]。早期可觀察到細胞核染色體發(fā)生邊聚，電子密度增強，核形不規(guī)整；胞質(zhì)濃縮，細胞體積變小。晚期可看見膜內(nèi)包裹有完整細胞器和細胞核碎片的凋亡小體。但電鏡檢測只能定性，不能定量，且對設備和檢測人員的水平要求較高，費用昂貴樣品制作過程復雜。

3.2 原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法（TUNEL法）檢測

TUNEL法[22,23]是利用末端轉(zhuǎn)移酶TdT將標記的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移到DNA缺口或3＇羥基末端上，常使用的核苷酸為dUTP，標記物為熒光素、地戈辛生物素等。TUNEL法不僅可以對凋亡細胞進行量化，而且可以動態(tài)觀察凋亡細胞超微結構的變化以及分析細胞表型。但是它的局限性為只能標記中期與晚期的凋亡細胞，而不能檢測只發(fā)生DNA大片段斷裂的凋亡細胞。染色體DNA斷裂后會產(chǎn)生大量的黏性3＇-OH末端，生物素標記的Dutp、過氧化物酶、堿性磷酸酶形成的衍生物在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下可與黏性末端結合，進行原位凋亡細胞的檢測[24-26]。正常細胞中為完整的雙鏈結構，無黏性末端的形成，故無陽性表現(xiàn)但由于壞死細胞中斷裂也可產(chǎn)生黏性末端，故可能出現(xiàn)假陽性結果，需要結合其它實驗方法加以排除。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測

ELISA法是定量檢測細胞凋亡的免疫化學方法。在細胞凋亡時由于Ca-Mg依賴性核酸內(nèi)切酶進入核小體內(nèi)，將雙鏈DNA從各核小體間連接處裂開，形成180～200bp或其整數(shù)倍的寡核苷酸片段。核小體內(nèi)的DNA與組蛋白形成緊密復合物，不被核酸酶裂解。將核小體上清液加入吸附有組蛋白抗體的微孔板，核小體組蛋白與抗組蛋白抗體結合。當加入過氧化物酶標記的DNA抗體后，DNA片段對過氧化物酶底物產(chǎn)生顯色反應。ELISA可用于貼壁培養(yǎng)細胞、懸浮培養(yǎng)細胞、血清、血漿等的檢測[27]。該方法可檢測早期細胞凋亡，靈敏度高，適用于多樣本。

3.4 線粒體膜電位的檢測

線粒體在凋亡中起關鍵作用，是一種電化學方法。線粒體膜電位是線粒體在尚未發(fā)生明顯的形態(tài)變化時，其膜電位已經(jīng)發(fā)生了變化。線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電子分布不對稱導致線粒體膜電位不平衡而形成電化學梯度，線粒體膜孔道大小的改變會導致線粒體膜電位的改變，從而調(diào)節(jié)細胞凋亡。線粒體膜電位在細胞凋亡早期已經(jīng)發(fā)生改變，而此時線粒體形態(tài)尚未出現(xiàn)明顯變化，所以線粒體膜電位的下降被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件[28]。

4 展望

細胞凋亡在股骨頭壞死發(fā)病過程中占有重要地位，是目前生命科學界熱門話題之一。細胞凋亡是受細胞內(nèi)源性基因、酶和信號傳導途徑調(diào)控的過程。鑒于骨細胞凋亡在股骨頭發(fā)生、發(fā)展機制中的重要地位，通過阻斷、干預凋亡進行治療的策略逐步得到廣泛的接受。近年來，國內(nèi)外均已開展了多項抗凋亡治療的研究，主要針對細胞凋亡的誘發(fā)因素、激活通路和凋亡調(diào)控基因等。降脂[29]可使抗凋亡基因bcl-2和bcl-XL上調(diào)，從而達到抑制細胞凋亡[30]，使我們在治療激素性股骨頭壞死上更進一步。

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10.3969/j.issn.1672-5972.2014.04.012

swgk2014-05-0100

劉玉（1986-）男，碩士，在讀研究生，醫(yī)師，工作方向：骨外科。

*[通訊作者]趙建民（1965-）男，教授，碩士研究生導師，主任醫(yī)師。工作方向：骨外科。

2014-05-20）

國家自然科學基金資助項目（81360224）

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010030