范 適, 劉志敏, 連 勇
(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林學(xué)院,湖南衡陽421005;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院,湖南長沙410128; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜花卉研究所,北京100081)
茄子小孢子培養(yǎng)及其在育種中的應(yīng)用
范 適1,3, 劉志敏2, 連 勇3*
(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林學(xué)院,湖南衡陽421005;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院,湖南長沙410128; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜花卉研究所,北京100081)
小孢子育種具有能縮短育種周期、便于發(fā)現(xiàn)有利隱性突變、能提高選擇效率等優(yōu)點(diǎn),比常規(guī)育種途徑有很大的優(yōu)勢.介紹了小孢子培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用、茄子花藥培養(yǎng)及小孢子培養(yǎng)的研究進(jìn)展、相關(guān)茄科作物的小孢子培養(yǎng)研究情況及存在的問題與今后的研究方向.參34.
茄子;花藥培養(yǎng);小孢子培養(yǎng);單倍體;育種
茄子(Solanum melongena L.)屬于茄科茄屬,起源于亞洲東南部熱帶地區(qū),以其產(chǎn)量高、供應(yīng)時(shí)間長、營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)在我國各地廣泛栽培,我國的茄子栽培面積636.862公頃,總產(chǎn)量約1 200萬噸,占世界總產(chǎn)量的54.5%,是我國重要的蔬菜作物之一.隨著生產(chǎn)的迅速發(fā)展,迫切需要新的育種技術(shù)的出現(xiàn),以便以更快的速度育成新的優(yōu)良品種,而通過小孢子培養(yǎng)獲得單倍體的途徑,比常規(guī)育種途徑有很大的優(yōu)勢.
1.1 能縮短育種周期
茄子屬常異花作物,天然雜交率為6.67%,一個(gè)含有目標(biāo)性狀基因育種材料的純合需自交5~6代,通常一個(gè)新品種的培育需7~8年時(shí)間,而利用小孢子培養(yǎng)得到單倍體的方法,則只需2年時(shí)間,因而加快了育種親本的純合速度,大大縮短了育種周期.
1.2 便于發(fā)現(xiàn)有利隱性突變
由于多數(shù)突變是隱性,當(dāng)同源染色體上有顯性等位基因存在時(shí),它們不能表現(xiàn),為了使隱性性狀表現(xiàn)出來,需進(jìn)行反復(fù)自交,且出現(xiàn)的機(jī)會很低.而在單倍體中,由于只有一套染色體,不受顯性等位基因的干擾,因而容易表現(xiàn)出來,且有利突變一經(jīng)發(fā)現(xiàn),就可通過染色體加倍,得到表現(xiàn)有利突變的可育二倍體.
1.3 能提高選擇效率
以自花授粉作物為例,一個(gè)雜交組合的二個(gè)親本如有一對等位基因:AA與aa,那么F2植株的基因型及頻率為:1/4aa,2/4Aa,1/4AA.但小孢子培養(yǎng)出來的純合二倍體的基因型及頻率是1/2aa,1/2AA.如果我們要選擇AA,那么AA在花粉植株中出現(xiàn)的頻率(1/2)比在種子繁殖的F2出現(xiàn)的頻率(1/4)高一倍.如果兩個(gè)親本有n對可自由組合的基因,則在F2中選出我們需要的基因型頻率是:1/22n(常規(guī))與1/2n,即花粉植株中選出所需基因型的機(jī)會比常規(guī)方法高出2n倍.即隨n的增大,選擇效率也越高.
獲得單倍體有三種途徑:一是從自然界中尋找,然而這種自然現(xiàn)象產(chǎn)生的頻率極低(通常為0.001% ~0.01%)[1].因此未得到廣泛應(yīng)用.二是孤雌生殖途徑,即通過培養(yǎng)未受精子房獲得單倍體植株.在茄子中至今未見成功的報(bào)道.三是通過花藥和小孢子培養(yǎng),這是目前最有效的方法.目前,已在一些蔬菜作物(如大白菜)的育種實(shí)踐中得到應(yīng)用[2].
早在七十年代,我國就對茄子的花藥培養(yǎng)進(jìn)行了研究.文獻(xiàn)[3]以北京六葉茄、九葉茄為材料對茄子花藥進(jìn)行離體培養(yǎng),得到了愈傷組織和胚狀體,篩選出適合茄子花藥培養(yǎng)的培養(yǎng)基MS,并對激素配比及作用進(jìn)行了研究,指出萘乙酸與激動(dòng)素的比例對于誘導(dǎo)根芽分化有重要的作用,其結(jié)果還表明,在生長素濃度低的培養(yǎng)基上,易形成胚狀體.在此基礎(chǔ)上,文獻(xiàn)[4]通過花藥培養(yǎng)首次獲得了單倍體植株,經(jīng)染色體加倍后獲得了較多的純合二倍體株系,對花粉植株根尖進(jìn)行染色體鑒定,發(fā)現(xiàn)有單倍體、二倍體、三倍體及非整倍體,為克服混倍現(xiàn)象,他們認(rèn)為通過胚狀體直接成苗是有效途徑.
然而,花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體植株的頻率低,能通過花藥培養(yǎng)獲得再生植株的基因型范圍窄,許多有價(jià)值的育種材料不能花藥培養(yǎng)獲得再生植株,以及花藥培養(yǎng)時(shí)由于藥莖和藥壁組織的干擾,沒有足夠的證據(jù)來說明再生植株的來源,而且倍性復(fù)雜,這些是花藥培養(yǎng)一直沒有成功地用于新品種選育的主要問題.
小孢子培養(yǎng)是文獻(xiàn)[5]在進(jìn)行曼陀羅花藥培養(yǎng)研究的同時(shí)創(chuàng)建的.茄科植物小孢子培養(yǎng)起步較早,已在煙草[6]、曼陀羅[7]、矮牽牛[8]等植物上獲得了成功.一般認(rèn)為茄科植物對小孢子培養(yǎng)比較敏感,但是不同的茄科作物的反應(yīng)相差很大,如煙草的小孢子培養(yǎng)系統(tǒng)已發(fā)展得比較完善,作為模式植物廣泛應(yīng)用于雄核發(fā)育的各種研究,然而其它茄科作物特別是茄果類蔬菜作物(番茄、甜辣椒、茄子)則很難誘導(dǎo)成苗.如番茄的小孢子培養(yǎng)目前最好的結(jié)果僅為文獻(xiàn)[9]用四個(gè)栽培種及一個(gè)野生種進(jìn)行直接游離小孢子培養(yǎng)時(shí)得到的球形胚、類心形胚等胚狀體.
對于茄子的小孢子培養(yǎng),文獻(xiàn)[10]報(bào)道獲得了單倍體植株,在隨機(jī)選擇的12株再生植株中,只有1株為單倍體,7株為自然加倍的二倍體.國內(nèi)只有文獻(xiàn)[11]在小孢子培養(yǎng)前進(jìn)行四天花藥預(yù)培養(yǎng),得到了愈傷組織.到目前為止,還未見其它成功的報(bào)道.
影響茄科小孢子培養(yǎng)的因素有以下幾個(gè)方面:
4.1 基因型
不同基因型在同樣的試驗(yàn)條件下,小孢子培養(yǎng)的效率是有差別的.文獻(xiàn)[12]對煙草(Nicotinan tabacuum L.)的四個(gè)不同基因型的小孢子進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)供體植株處于同樣的栽培環(huán)境下,它們之間的胚胎發(fā)生能力有明顯差異,發(fā)生頻率變化范圍為4.5%~28.7%.文獻(xiàn)[13]用栽培番茄的小孢子進(jìn)行培養(yǎng),在有的栽培品種中得不到類球形胚.可見基因型的差異在小孢子培養(yǎng)中是普遍存在的.
4.2 供體植株的生長環(huán)境
供體植株的栽培環(huán)境對小孢子胚胎發(fā)生亦有影響,其中溫度的影響較大.文獻(xiàn)[9]在番茄游離小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)薯葉番茄5月下旬與10月份花蕾的類胚發(fā)生率分別為0.01%和0.25,并認(rèn)為可能是天然的低夜溫影響了供體植株體內(nèi)的小孢子發(fā)育方向,使其偏離了配子體方向發(fā)育,從而脫分化形成胚狀體.在煙草的小孢子培養(yǎng)中,文獻(xiàn)[14,15]發(fā)現(xiàn)短日照(8 h)及低溫(18℃)[16]下生長的供體植株,其小孢子培養(yǎng)效率高;對供體植株施行氮饑餓[17,18]及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(如 NAA、Alar85)[18]處理,可提高小孢子胚誘導(dǎo)率,文獻(xiàn)[14]認(rèn)為是這些條件改變了供體植株內(nèi)的營養(yǎng)合成或(和)運(yùn)轉(zhuǎn),使發(fā)育中的小孢子處于營養(yǎng)饑餓狀態(tài),從而偏離了配子體方向的發(fā)育而轉(zhuǎn)向孢子體方向發(fā)育.
4.3 小孢子發(fā)育時(shí)期
小孢子所處的發(fā)育時(shí)期是培養(yǎng)能否成功的因素之一.一般認(rèn)為茄科植物適用的范圍是單核中期至雙核中期,但不同的種類的作物其最適時(shí)期有所不同,如煙草宜選用單核期小孢子[19],馬鈴薯用單核末期的小孢子較好[20].如果在小孢子培養(yǎng)前進(jìn)行花蕾、花藥等各種預(yù)處理,則要求的小孢子發(fā)育時(shí)期稍早,因?yàn)橐话阏J(rèn)為小孢子在各種預(yù)處理中仍可繼續(xù)發(fā)育[21].
4.4 培養(yǎng)技術(shù)
4.4.1 低溫預(yù)處理
把待分離小孢子的花序、花蕾或花藥放在較低的溫度下(4℃~10℃)處理一段時(shí)間,可提高小孢子胚的誘導(dǎo)率.文獻(xiàn)[19]低溫處理煙草花蕾后,小孢子分裂指數(shù)上升.文獻(xiàn)[22]將曼陀羅的花藥于4℃下4處理4天,分離出來的小孢子可形成胚,而未經(jīng)處理的小孢子則不反應(yīng).文獻(xiàn)[9]在番茄游離小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),即使供體植株處于低溫環(huán)境下,小孢子類胚發(fā)生率提高.由此推測低溫預(yù)處理對茄科植物的小孢子脫分化誘導(dǎo)是有效的.
4.4.2 高溫預(yù)處理(或熱激處理)
小孢子經(jīng)過分離純化后,在正常溫度下培養(yǎng)之前,先放在高于正常培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間的處理,稱為高溫預(yù)處理,亦為熱激[23].文獻(xiàn)[10]在對茄子進(jìn)行直接游離小孢子培養(yǎng)時(shí),認(rèn)為蔗糖饑餓與熱激兩個(gè)處理對于愈傷的誘導(dǎo)是必不可少的,在35℃高溫時(shí),愈傷的誘導(dǎo)率最高,而在培養(yǎng)溫度25℃時(shí)卻幾乎沒有愈傷的形成.文獻(xiàn)[24]33℃熱激處理煙草小孢子2天可提高小孢子胚誘導(dǎo)率.在蕓苔屬的小孢子培養(yǎng)中也得到了類似的結(jié)果,文獻(xiàn)[25]在油菜中摸索到了在通過高溫和低溫來控制小孢子的發(fā)育命運(yùn),他們的結(jié)果顯示,預(yù)處理期間32.5℃高溫?zé)峒ぬ幚?天可使小孢子朝胚胎發(fā)生途徑并進(jìn)而形成胚,17.5℃低溫2天則導(dǎo)致小孢子朝配子體成熟的途徑發(fā)育.文獻(xiàn)[26]的研究表明, 33℃熱激處理24~72小時(shí)是誘導(dǎo)小白菜小孢子胚胎發(fā)生的必要條件.
4.4.3 營養(yǎng)饑餓
營養(yǎng)饑餓對于煙草小孢子胚的誘導(dǎo)似乎是必需的,文獻(xiàn)[27-28]報(bào)道煙草小孢子培養(yǎng)前在蒸餾水中處理幾天,能誘導(dǎo)小孢子脫分化的啟動(dòng).文獻(xiàn)[29]成功地運(yùn)用谷氨酰胺的添加來控制煙草離體小孢子的發(fā)育方向,在含有谷氨酰胺的培養(yǎng)基上培養(yǎng),小孢子朝孢子體方向發(fā)育,反之,則朝配子體方向發(fā)育.文獻(xiàn)[10,24]在煙草和茄子的小孢子培養(yǎng)中認(rèn)為,在小孢子培養(yǎng)之前的短時(shí)期營養(yǎng)饑餓處理對小孢子脫分化是必需的.文獻(xiàn)[15]推測,一些環(huán)境條件(如短日照(8 h)、低溫(18℃)[16]、氮饑餓[17,18]、生長調(diào)長物質(zhì)處理:NAA[18]對供體植株的影響可能是因?yàn)檫@些條件妨礙了供體植株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn),從而引起供體植株處于營養(yǎng)饑餓狀態(tài),導(dǎo)致小孢子偏離了配子體發(fā)育方向.由此推測營養(yǎng)饑餓處理對于茄科植物小孢子脫分化的啟動(dòng)是有效的.
在目前大多數(shù)成功的例子中,似乎只有在小孢子培養(yǎng)前經(jīng)過各種處理(如低溫、熱激、營養(yǎng)饑餓等)才能啟動(dòng)小孢子脫分化并進(jìn)而發(fā)育成植株.在小孢子脫分化啟動(dòng)機(jī)理方面,科學(xué)家作了許多有益的探索.文獻(xiàn)[24]認(rèn)為,熱激及其它些物理、化學(xué)方面的脅迫處理可能在小孢子內(nèi)部產(chǎn)生了同樣(或重疊)的效果,如產(chǎn)生一些特定的熱激蛋白(HSPs).文獻(xiàn)[30]在小孢子培養(yǎng)前熱激處理,得到了一些特異性mRNA和蛋白質(zhì),并指出一些蛋白質(zhì)可能是熱激蛋白(HSPs).文獻(xiàn)[31]在煙草小孢子培養(yǎng)前應(yīng)用營養(yǎng)饑餓處理也得到了相似的結(jié)果.
4.5 培養(yǎng)基
茄科作物小孢子培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基有Nitsch、MS、White和B5.
培養(yǎng)基中的糖類、植物激素、添加物等對小孢子培養(yǎng)的結(jié)果有影響.文獻(xiàn)[32]認(rèn)為小孢子培養(yǎng)對蔗糖的要求十分專一,不能用代謝不活潑的化合物或其它雙糖代替.文獻(xiàn)[29]研究發(fā)現(xiàn)半乳糖可以誘使煙草花粉分裂,但若缺乏蔗糖,這些分裂的花粉則不能進(jìn)一步發(fā)育分化.茄科作物小孢子培養(yǎng)所要求的蔗糖濃度較低,一般為2%~4%.對于植物激素的作用有些爭議,一般認(rèn)為低濃度的生長素類物質(zhì)可提高胚狀體的誘導(dǎo)頻率,而高濃度則易產(chǎn)生愈傷組織和使細(xì)胞倍性復(fù)雜化[33].在培養(yǎng)基中添加活性碳,對于小孢子培養(yǎng)是有益的,能提高小孢子胚的誘導(dǎo)率[2],因?yàn)樗軌蛭脚囵B(yǎng)基中的抑制物質(zhì)以及瓊脂中的雜質(zhì),但也能吸收有益物質(zhì)如Fe-EDTA,添加性碳雖然提高了胚的發(fā)生率,但是不正常胚的數(shù)目增多[34].
小孢子培養(yǎng)較花藥培養(yǎng)有許多優(yōu)越性:第一,它排除了藥壁組織的干擾,產(chǎn)生的胚及再生植株都可靠地來自小孢子群體;第二,能在較寬的基因型范圍內(nèi)以高的誘導(dǎo)率獲得小孢子胚和再生植株.第三,小孢子植株還具有自然加倍成為二倍體的特點(diǎn).因此,游離小孢子培養(yǎng)在遺傳育種研究方面具有十分誘人的應(yīng)用前景.
但在應(yīng)用中仍存在一些問題,如胚狀體或愈傷組織的誘導(dǎo)率低,成苗難.由于基因型的差異也使許多優(yōu)良的單株或品系不能快速通過單倍體的途徑應(yīng)用于育種中.在理論上,由于小孢子脫分化啟動(dòng)機(jī)理尚處于猜測、探討階段,在實(shí)際工作中造成很大的局限性.為加強(qiáng)這種技術(shù)在育種中的應(yīng)用,需在小孢子的誘導(dǎo)機(jī)制、啟動(dòng)機(jī)理、遺傳因素等方面作深入的研究,以使小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種中揮更大的作用.
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Research Progress in Breeding of Eggplant M icrospore Culture
FAN Shi1,3, LIU Zhi-m in2, LIAN Yong3
(1.Lanedscape Department,Hunan Enviromen-Biological Polytechnic,Hengyang 421005,China;2.Horticulture and Landscape College,Hunan Agriculture University,Changsha 410128,China;3.The Institute of Vegetable and Flowers,Chinese Academy of Agriculture Sciences,Beijing 10081,China)
Microspore breeding can short the breeding cycle,find favourable recessive mutation,improve the selection efficiency.It hasmore advantages than the conventional breedingmethods.This paper introduces the application ofmicrospore culture in breeding,the research progress of anther culture and microspore culture of eggplant.This paper points out the existing problems,puts forward the research direction in the future.34refs.
Eggplant;anther culture;microspore culture;haploid;breeding
文獻(xiàn)標(biāo)識碼:
2014-12-23
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院與歐盟合作研究項(xiàng)目,農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目
范 適(1969-),男,湖南衡陽人,博士,副教授,研究方向:植物組織培養(yǎng).
*通訊作者,E-mail:lianyong@caas.cn