賀百花

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,湖南衡陽421001)

三葉蟲茶茶多酚提取工藝研究

賀百花1,2

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,湖南衡陽421001)

研究萃取-沉淀法從蟲茶中提取分離茶多酚的影響因素.采用單因素循環(huán)法考慮各影響因素,得出三葉蟲茶茶多酚的最優(yōu)提取工藝.用回流法提取茶多酚,并用單因素循環(huán)法分別考察提取劑、沉淀劑、轉(zhuǎn)溶酸、萃取次數(shù)對(duì)茶多酚提取率的影響,用紫外-可見分光光度法對(duì)提取液進(jìn)行檢測(cè).用萃取-沉淀法從蟲茶中提取分離茶多酚,以80%丙酮作提取劑,ZnCl2作沉淀劑,鹽酸轉(zhuǎn)溶的效果較為理想.結(jié)論表明,萃取-沉淀法提取分離蟲茶中茶多酚,所需要的有機(jī)溶劑少,能耗低,純度高,具有可行性.圖4,表5,參14.

蟲茶;萃取-沉淀法;茶多酚;分離

蟲茶,是特種植物被特種昆蟲取食后,經(jīng)昆蟲體內(nèi)特殊的生理生化學(xué)反應(yīng)排出糞粒,這種糞粒經(jīng)加工后被人們當(dāng)作茶用,故又名“蟲釀茶”,民間叫“蟲茶”[1],是仡佬族、彝族、苗族、土家族等少數(shù)民族的民間飲品和傳統(tǒng)中藥[2],具有抗氧化[3,4]、降血壓[5,6]、降血糖[7,8]、抑菌[9]等作用,三葉蟲茶中白楊素苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎有明顯的抑制作用[10-12].

根據(jù)文獻(xiàn)[1]對(duì)蟲釀茶的命名規(guī)則,由米縞螟Aglossa dimidiata Haworth幼蟲(又名米黑蟲,屬鱗翅目螟蛾科昆蟲)取食三葉海棠植物(Malussiebodii)葉后排出的糞粒,經(jīng)過加工處理,稱為三葉海棠蟲釀茶,簡稱三葉蟲茶.茶多酚(三葉蟲茶中的多酚類物質(zhì))是三葉蟲茶中的主要有效成分,茶多酚其由黃烷醇類、花色素類、黃酮醇類、花白素類、酚酸及縮酚酸類等6類化合物組成.黃烷醇類即通常所稱的兒茶素,約占茶多酚的70%,主要包括沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素和兒茶素.

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品,三葉蟲茶(湖南,2012年購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)民家),丙酮,無水乙醇,無水氯化鈣,氯化鎂,硫酸鋅,氯化鋅,硫酸,鹽酸,氨水,乙酸乙酯均為分析純.

1.2 儀器

800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠);

磁力加熱攪拌器(南匯電訊器材廠);

UV-265FW紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津);

恒溫水浴鍋(北京國華醫(yī)療器械廠);

SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峽予華儀器廠);

PHS-3C數(shù)字酸度計(jì)(杭州東星儀器設(shè)備廠)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶劑回流-沉淀劑沉淀提取

稱取20 g或25 g蟲茶于圓底燒瓶,加入100 mL溶劑(水、80%乙醇、80%丙酮),在一定的溫度下(90℃,80℃,70℃)水浴加熱回流,回流1 h,趁熱抽濾,其濾渣再用100 mL溶劑回流40 min后趁熱過濾,重復(fù)2次,合并2次濾液并水浴回收部分溶劑,定容至250 mL,即得粗提取液.取5 mL粗提取液加入一定量的固體沉淀劑(CaCl2,MgCl2,ZnCl2, ZnSO4),在磁力攪拌器上攪拌15 min,再用2 mol/L氨水調(diào)pH值到7.5左右,3 000 r/min離心分離,棄去上清液即得沉淀物,沉淀物用蒸餾水洗滌2次,每次5 mL,得茶多酚沉淀物.

1.3.2 轉(zhuǎn)溶和乙酸乙酯萃取

在沉淀物中加入15 mL 2 mol/L酸(硫酸、鹽酸)轉(zhuǎn)溶15 min,并不斷攪拌,以2 mol/L的氨水調(diào)pH值到4左右,離心分離,得到上清液稱酸水.取得一定量酸水樣品(5 mL或15 mL),加入20 mL乙酸乙酯萃取,將萃取液定容至25 mL,既得酯萃取液.水浴回收大部分酯,將濃縮液移至燒杯,在120～130℃條件下蒸發(fā)干燥即得茶多酚粗品,粗品可用作為抗氧劑用于食品加工,也可精致得到純度較高的茶多酚.

1.3.3 檢測(cè)

以不同提取溶劑、沉淀劑、轉(zhuǎn)溶酸按照1.3.1與1.3.2項(xiàng)下的方法對(duì)茶多酚進(jìn)行提取分離,得到的酯萃取液經(jīng)稀釋,以乙酸乙酯為空白,波長200～400 nm范圍內(nèi)掃描其圖譜.測(cè)定275 nm處各樣品的吸光度值.

取三葉蟲茶茶多酚類物質(zhì)供試液和 0.04 mg/mL的單寧酸對(duì)照液按照1.3.1與1.3.2項(xiàng)下的方法對(duì)茶多酚進(jìn)行提取分離,得到的酯萃取液經(jīng)稀釋.分別置于1 cm石英比色皿中,在紫外分光光度計(jì)上,以乙酸乙酯為空白,測(cè)定200～400 nm的UV光譜.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二者均在275 nm處有吸收峰.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13],多酚類物質(zhì)在270～280 nm處有吸收峰.因此該文取不同條件下制得酯萃取液在在λmax275 nm處的吸光度測(cè)定萃取液中多酚類物質(zhì)的含量,以此作為提取條件和工藝研究的評(píng)價(jià)指標(biāo)[14].

取0.1 g單寧酸作為標(biāo)準(zhǔn)品溶于100 mL乙酸乙酯中,從中取1mL稀釋至25mL所得溶液作標(biāo)準(zhǔn)液,此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為0.04 mg/mL,測(cè)λmax處的吸光A為0.235,由此可按下式估計(jì)算出三葉蟲茶中茶多酚以單寧酸計(jì)算的收率(%):

收率(%)=(A樣/A標(biāo))*C標(biāo)*D/W總*1 000.其中:A樣——2.1,2.2,2.3,2.4,2.5中各樣品吸收光度

A標(biāo)為單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液吸光度;

D為換算因子;

W總為蟲茶的質(zhì)量.

2 結(jié) 果

2.1 溶劑類型的影響

不同溶劑的提取物UV檢測(cè)情況:

除按1.3.1與1.3.2項(xiàng)下的操作外,其它需要確定的處理?xiàng)l件(下面均簡稱為處理?xiàng)l件):蟲茶20 g、0.3 g CaCl2作沉淀劑,用2 mol/L硫酸轉(zhuǎn)溶,取5 mL酸水液用乙酸乙酯萃取,所得酯萃取液,從中取1 mL稀釋至5 mL,以乙酸乙酯為空白測(cè)得UV光譜,(見圖1),數(shù)據(jù)見表1.

圖1 不同溶劑提取物UV圖譜Fig.1 UV spectroscopy of different extracts

表1 溶劑類型的影響Tab.1 Influence of solvent

由實(shí)驗(yàn)可知,在浸提階段所用的溶劑對(duì)茶多酚提取影響較大,并以水浸提的提取率最低,而以80%丙酮提取率最高.(因此考察其它因素時(shí)均用80%丙酮提取液)

2.2 轉(zhuǎn)溶酸的影響

處理?xiàng)l件:蟲茶20 g,80%丙酮作提取劑,0.3 gCaCl2作沉淀劑,不同酸轉(zhuǎn)溶,取5 mL酸水液用乙酸乙酯萃取,得酯萃取液,從中取1 mL稀釋至15 mL,以乙酸乙酯為空白測(cè)得UV光譜,(見圖2),結(jié)果見表2.

圖2 不同酸轉(zhuǎn)溶提取物UV圖譜Fig.2 UV spectroscopy of different acids conversion solution

表2 不同轉(zhuǎn)溶酸的影響Tab.2 Influence of different acids conversion solution

由實(shí)驗(yàn)可知,鹽酸轉(zhuǎn)溶時(shí)茶多酚收益較好.

2.3 沉淀劑的影響

處理?xiàng)l件:蟲茶25 g,80%丙酮提取,不同沉淀劑沉淀,2 mol/L HCl轉(zhuǎn)溶,取15 mL酸水試樣用乙酸乙酯萃取,從中取2 mL稀釋至25 mL,以乙酸乙酯為空白測(cè)得UV光譜,(見圖3),結(jié)果見表3.

圖3 不同沉淀劑提取物UV圖譜Fig.3 UV Spectroscopy of Different Precipitant

表3 沉淀劑的影響Tab.3 Influence of different precipitant

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出:沉淀劑以MgCl2收率最低,以ZnCl2的收率最高.

2.4 萃取次數(shù)的確定

處理?xiàng)l件:蟲茶20 g,0.305 g ZnCl2作沉淀劑,鹽酸轉(zhuǎn)溶,取15mL酸水液用20mL乙酸乙酯萃取,得酯萃取液,從中取2 mL稀釋至25 mL,測(cè)UV,其酸水液再用10 mL乙酸乙酯萃取后,定容至10 mL,以乙酸乙酯為空白測(cè)得UV光譜,數(shù)據(jù)見表4

圖4 不同萃取次數(shù)UV圖譜Fig.4 UV Spectroscopy of different extraction times

表4 萃取次數(shù)的影響Tab.4 Influence of different extraction times

由上述可知,第一次乙酸乙酯萃取液中的茶多酚以單寧酸計(jì)算濃度為3.960 mg/mL,第二次乙酸乙酯萃取液中濃度為0.197 mg/mL,兩次萃取溶度比為20.1倍,第一次與第二次萃取的質(zhì)量比為40.2.

2.5 優(yōu)化工藝的平行實(shí)驗(yàn)

處理?xiàng)l件:蟲茶20 g,80%丙酮作提取劑,0.405 g ZnCl2作沉淀劑,鹽酸轉(zhuǎn)溶,取5 mL酸水液用乙酸乙酯萃取,得酯萃取液,從中取1 mL稀釋至15 mL,做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)UV,數(shù)據(jù)見表5

表5 優(yōu)化工藝平行實(shí)驗(yàn)Tab.5 Parallel experiments of optimized techniques

由此可得出,三葉蟲茶中茶多酚的收率為14.57%,其收率的RSD為0.4%,說明該法茶多酚的提取率較高,重復(fù)性良好,工藝穩(wěn)定.

3 討 論

近年來,因茶多酚臨床作用和保健作用研究頗多,茶多酚的提取和分離受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注.茶多酚的提取方法主要有:離子沉淀法、溶劑提取法、超臨界流體萃取法、樹脂吸附分離法、微波浸提法、鹽吸法、超聲波浸提法和低溫純化酶提取法等方法.但從國內(nèi)已有報(bào)道看,茶多酚提取率很低(不到15%),這可能與茶多酚結(jié)構(gòu)有關(guān),茶多酚以兒茶素類黃烷醇,兒茶素類化合物結(jié)構(gòu)中有多個(gè)苯酚基,在空氣中極易被氧化,所以在實(shí)際操作過程中,茶多酚提取率偏低.目前,三葉蟲茶中茶多酚的提取分離研究不多,其提取率也不高,提取工藝還需要進(jìn)一步改進(jìn).該實(shí)驗(yàn)用萃取-沉淀法提取分離茶多酚,其原理及存在問題如下:

三葉蟲茶由于包含茶多酚等物質(zhì)而呈酸性,它能夠與水溶液中的金屬離子作用形成沉淀,因而能利用這一原理將茶多酚沉淀,與其它物質(zhì)分離.用方程式可表示為:

但對(duì)于不同金屬離子形成沉淀的能力不同.各離子沉淀的環(huán)境也有區(qū)別,偏堿性沉淀劑能誘發(fā)茶多酚的氧化反應(yīng),對(duì)于ZnSO4,ZnCl2來說,Zn2+較適合在弱酸性環(huán)境,與茶多酚提取適宜環(huán)境接近,有利于茶多酚提取分離.以它們?yōu)槌恋韯┎瓒喾拥氖章瘦^高的主要原因是由于Zn2+具有3d10電子結(jié)構(gòu),與茶多酚可以形成絡(luò)合型沉淀,存在水中的茶多酚沉淀得較為完全.用平衡式可表示為: [Ⅱ]可與Zn2+形成絡(luò)合沉淀,使得上述平衡右移,茶多酚沉淀較完全.因此采用Zn2+作沉淀劑,既可保證較高的產(chǎn)品收率,又可避免采用Al3+,Ba2+等離子對(duì)產(chǎn)品安全性造成的嚴(yán)重影響.

該文茶多酚的檢測(cè)用的對(duì)照物是單寧酸,單寧酸不是單一化合物,而是混合物,化學(xué)成分比較復(fù)雜,大致可分為兩類,一類是縮合單寧,即黃烷醇衍生物,分子中黃烷醇的第2位通過C-C鍵與兒茶酚或苯三酚結(jié)合.一類是可水解的單寧,分子中具有酯鍵,是葡萄糖的沒食子酸酯.其分子式: C76H52O46,分子量:1 701.22,單寧酸和茶多酚紫外吸收類似,所以用單寧酸做對(duì)照品.

該實(shí)驗(yàn)得出優(yōu)化工藝的提取劑為80%的丙酮,但因丙酮毒性較大,而乙醇的毒性相對(duì)小,所以在實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)中,常用80%的乙醇做提取劑.優(yōu)化工藝的轉(zhuǎn)溶酸為2 mol/L鹽酸,實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中要注意控制pH.pH值不僅影響著茶多酚絡(luò)合物轉(zhuǎn)溶效果,而且還影響著茶多酚的穩(wěn)定性.pH值的波動(dòng)大,容易引起茶多酚的氧化反應(yīng).優(yōu)化工業(yè)的沉淀劑為ZnSO4,而有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道用Zn2+和Al3+復(fù)合離子沉淀分離三葉蟲茶中的茶多酚效果好,但該文并未選擇Al3+作沉淀劑是因?yàn)锳l3+會(huì)引發(fā)老年癡呆癥,Al3+的過分殘留可能限制茶多酚的應(yīng)用范圍.

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Study on Extraction Techniques of Trilobite Tea Polyphenols

HE Bai-hua1,2

(1.School of Medicine,Hunan Polytechnic of Environment and Biology,Hengyang 421005,China;2.School of Pharmaceutical and Biological Science,University of South China,Hengyang 421001,China)

Analysis of the factors that influenced the extraction and separation of tea polyphenols from trilobite tea with themethod of extraction-precipitation.To find out the best technique to extract trilobite tea polyphenols bymeans of single factor circle.Circumfluence process was used to extract tea polyphenols.Single factor circlemethod was carried out to investigate the influence of extractant,precipitant,acids conversation solution and extraction times on the extraction rate of tea polyphenols.UV spectrophotometry was applied to test the extracting solution.Acids conversation solution was rather satisfying when 80%acetone as extraction and Zncl2as precipitant were made.The method of extraction-precipitation,which is characterized with less organic solvent needed,less energy consumed aswell as higher purity,was feasible to extract tea polyphenols.4figs.,5tabs.,14refs.

trilobite tea;extraction-precipitation;tea polyphenols;sepatation

R284.2

A

2095-7300(2014)04-040-05

2014-09-03

賀百花(1983-),女,湖南衡陽人,碩士,講師,研究方向:中藥學(xué).