單國(guó)燕等

摘 要 以熱研2號(hào)柱花草花藥為外植體，研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 、培養(yǎng)基以及低溫預(yù)處理等對(duì)柱花草花藥培養(yǎng)的影響，以期建立柱花草花藥培養(yǎng)體系，獲得再生植株，為柱花草倍性、基因組學(xué)及分子生物學(xué)研究提供材料。關(guān)鍵詞 柱花草 ；花藥培養(yǎng) ；愈傷組織誘導(dǎo) ；不定芽分化

分類(lèi)號(hào) S541.04

In Vitro Anther Culture of Stylosanthes

SHAN Guoyan1，2） ZHENG Jinlong1，2） GAO Jianming1，2，3）

CHEN Helong1，2，3） ZHANG Shiqing1，2，3） YI Kexian1，2）

（1 Environment and Plant Protection Institute，CATASs，Haikou，Hainan 571101，P.R. China；

2 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology， Haikou， Hainan 571101；

3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou，Hainan 571101，P.R. China）

Abstract In order to establish an efficient anther culture system of Stylosanthes， get regenerate plantlet and provide basic materials for the research of ploidy， genomics and molecular biology of Stylosanthes. This experiment taking the anther of Stylosanthes guianensis cv， Reyan2 as explants to study the effect of plant growth regulator， medium and low temperature pretreatment on Stylosanthes anther culture. The results indicated that low temperature pretreatment for 24 h was better than other treatments. N6 medium supplemented with 2，4-D 0.5 mg/L，KT 1.0 mg/L was the best for induction of cullus. MS +NAA 0.2 mg/L + 6-BA 3.0 mg/L was the best for regeneration culture.

Keywords Stylosanthes ； anther culture ； callus induction ； division of adventitious bud

柱花草（Stylosanthes spp.）又名筆花豆，是全球熱帶地區(qū)栽培面積最大、應(yīng)用最廣泛的優(yōu)良豆科牧草。柱花草原產(chǎn)于南美洲，該屬有44個(gè)以上的種或亞種[1]。柱花草炭疽病是威脅其推廣種植的主要障礙，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在柱花草種質(zhì)資源的收集、引種選育，從體細(xì)胞變異或體細(xì)胞融合技術(shù)中獲得抗炭疽病植株以及利用遺傳工程獲得抗病轉(zhuǎn)基因植株等方面展開(kāi)了多項(xiàng)研究[2-6]。國(guó)外在20世紀(jì)60年代就開(kāi)展了柱花草的組織培養(yǎng)研究[7-8]，但由于所使用的基因型有限，成效不顯著。隨著遺傳工程技術(shù)的日益成熟，通過(guò)該技術(shù)培育更多優(yōu)良的柱花草品種希望較大。同科柱花草不同品種的組織培養(yǎng)技術(shù)國(guó)內(nèi)外已有成功的報(bào)道[9-13]。但是目前關(guān)于柱花草花藥培養(yǎng)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

花藥培養(yǎng)作為一種新的育種手段，在很多作物育種中得到應(yīng)用。通過(guò)花藥培養(yǎng)可誘導(dǎo)花粉發(fā)育形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期，還有利于誘導(dǎo)花藥形成隱型突變體，提高選擇效率。所誘導(dǎo)出的單倍體僅有一套染色體，它具有特殊的遺傳學(xué)特征：（1）遺傳的（染色體的）穩(wěn)定性和變異性；（2）小孢子無(wú)性系變異；（3）遺傳基因型在純合的植株水平上充分表達(dá)。所以，不僅是研究遺傳、變異、重組和表達(dá)等遺傳學(xué)問(wèn)題的一個(gè)理想體系[14]，通過(guò)它還可以迅速得到DH 群體、克服遠(yuǎn)緣雜交不育性、提高育種效率。本試驗(yàn)主要研究影響柱花草花藥培養(yǎng)的因素，旨在建立柱花草花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，為今后開(kāi)展柱花草遺傳育種研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

材料為‘熱研2號(hào)柱花草的花藥，取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶牧草研究中心。

1.1.2 試驗(yàn)用品

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

2.1.1 愈傷組織形成

柱花草花藥離體培養(yǎng)1周左右開(kāi)始膨大，部分花藥顏色由黃色變淡黃色至黃褐色，個(gè)別花藥出現(xiàn)晶狀小水珠。2周左右某些花藥顏色發(fā)亮，經(jīng)過(guò)1～2 d，發(fā)亮的花藥逐漸開(kāi)裂，并從縊痕處生出小白點(diǎn)，逐漸擴(kuò)大體積，顏色由白變淡黃或黃綠色，這就是愈傷組織。大多數(shù)在20 d左右形成愈傷組織，剛開(kāi)始愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，但以后逐漸加快，接種20～30 d為愈傷增殖高峰期，35 d后逐漸有褐化現(xiàn)象出現(xiàn)。愈傷組織的形態(tài)大致可以分為2種，一種是質(zhì)地疏松的白色組織，另一種是質(zhì)地致密的黃綠色組織，有緊實(shí)型和疏松型，緊實(shí)型中又分表面光滑和不光滑2種。前者顏色較深，在培養(yǎng)過(guò)程中慢慢老化死亡，或不分化；后者生長(zhǎng)旺盛，分裂能力強(qiáng)，分化成苗的潛力大。故緊實(shí)表面不光滑、黃綠色的愈傷組織，具有分化成帶有綠色芽點(diǎn)和植株的能力。endprint

2.1.2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)柱花草花藥愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)

培養(yǎng)基類(lèi)型對(duì)花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率有明顯影響，花藥在不同培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)也不同（表2）。在2種基本培養(yǎng)基比較試驗(yàn)種，以N6培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，MS次之。同時(shí)，N6培養(yǎng)基上的愈傷組織發(fā)生時(shí)間最早，愈傷組織直徑也大于MS培養(yǎng)基所誘導(dǎo)的愈傷組織。N6培養(yǎng)基對(duì)柱花草花藥愈傷組織誘導(dǎo)的效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基。試驗(yàn)說(shuō)明，不同基本培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)柱花草花藥愈傷差異較大。以N6培養(yǎng)基最適合柱花草花藥愈傷誘導(dǎo)。

2.1.3 培養(yǎng)基及附加成分對(duì)愈傷組織形成的影響

柱花草花藥接種于12種培養(yǎng)基上（表3），2.3 生根培養(yǎng)

在分化培養(yǎng)基中的苗長(zhǎng)到4～5 cm的時(shí)候，將叢生芽由愈傷組織上切下，在無(wú)菌條件下分成細(xì)小的單株和健壯的單株，分別轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基M13和M14中。轉(zhuǎn)接后約過(guò)10 d開(kāi)始生根，生根率均可達(dá)90%以上。

3 討論與結(jié)論

（1） 低溫預(yù)處理對(duì)柱花草花藥培養(yǎng)的影響

有研究認(rèn)為，低溫預(yù)處理的作用是能夠提供一個(gè)更適合的環(huán)境，以利于愈傷組織誘導(dǎo)和誘導(dǎo)期花藥存活。接種前的低溫處理有利于提高花藥培養(yǎng)效率，但確切的機(jī)制尚不清楚，可能與一種分子量為32 ku的蛋白質(zhì)有關(guān)[16]。自Nitsch等[17]于1973年首次發(fā)現(xiàn)低溫預(yù)處理可提高毛葉曼陀羅花藥培養(yǎng)中胚狀體的形成以來(lái)，水稻、小麥、大麥等多種作物的花藥培養(yǎng)用低溫預(yù)處理后均可不同程度地提高花粉愈傷組織或花粉胚狀體的誘導(dǎo)頻率[18-20]。本試驗(yàn)中，分別對(duì)柱花草花藥進(jìn)行4℃低溫預(yù)處理24、48、72 h，其愈傷組織誘導(dǎo)率均高于對(duì)照，在這一點(diǎn)上，與大多數(shù)植物的花藥培養(yǎng)相似。

（2） 基本培養(yǎng)基對(duì)柱花草花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。選擇不同的基本培養(yǎng)基，對(duì)柱花草花藥愈傷組織誘導(dǎo)有著明顯的影響，因此有人研制專(zhuān)門(mén)的培養(yǎng)基及其附加物，如針對(duì)煙草花培的H和T培養(yǎng)基[21]。本實(shí)驗(yàn)選取MS、N6兩種培養(yǎng)基對(duì)花藥誘導(dǎo)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，愈傷組織發(fā)生時(shí)間最早，而且愈傷組織在繼代培養(yǎng)過(guò)程中色澤、質(zhì)地均優(yōu)于N6培養(yǎng)基。因此，在進(jìn)行柱花草花藥培養(yǎng)時(shí)，可選擇MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，以提高花藥培養(yǎng)效率。

（3） 激素處理對(duì)柱花草花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在培養(yǎng)基中加入不同的激素種類(lèi)及濃度，對(duì)柱花草花藥愈傷組織的誘導(dǎo)有不同的影響。培養(yǎng)基中激素的種類(lèi)、用量和配比，對(duì)誘發(fā)小孢子啟動(dòng)、分裂、生長(zhǎng)和分化起決定性作用，一般低濃度的生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)可提高胚狀體的誘導(dǎo)率[22]。有研究[23]表明，愈傷組織的誘導(dǎo)形成，生長(zhǎng)素是必需的，其中2，4-D應(yīng)用較多，附加一定濃度的細(xì)胞分裂素效果可能更好。本試驗(yàn)結(jié)果表明：在柱花草花藥培養(yǎng)中，2，4-D對(duì)愈傷組織的形成是必不可少的，并且2，4-D與KT配合使用比單獨(dú)使用KT、6-BA的誘導(dǎo)效果好。不同激素配比對(duì)柱花草花藥培養(yǎng)的效果有待進(jìn)一步研究。

柱花草花藥培養(yǎng)是獲得無(wú)毒苗的途徑之一，其優(yōu)點(diǎn)是脫毒率高、安全可靠。在提高花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率的基礎(chǔ)上，將花藥培養(yǎng)技術(shù)與細(xì)胞離體篩選、誘變、轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，可在短時(shí)間內(nèi)培育出柱花草新品種。特別是以花藥培養(yǎng)單倍體愈傷組織或植株作為轉(zhuǎn)化受體，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，在柱花草轉(zhuǎn)化研究中具有廣泛應(yīng)用前景。

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