陳玉娟,尹建雯,古文鵬,李超群,楊建斌,徐 聞,伏曉慶

云南省是傷寒副傷寒的高發(fā)地區(qū)之一，近年來發(fā)病率及發(fā)病數(shù)均居全國(guó)首位。而玉溪市、紅河州和德宏州,尤其玉溪市是云南省傷寒副傷寒的高發(fā)地區(qū)。近年來，云南省的發(fā)病情況以副傷寒為主，特別是甲型副傷寒逐漸成為了優(yōu)勢(shì)菌株。其中又以玉溪市的甲型副傷寒發(fā)病最為嚴(yán)重。我們通過對(duì)云南省2005-2012年8年間監(jiān)測(cè)的91株甲型副傷寒沙門菌進(jìn)行病原學(xué)特征分析，從菌株的耐藥性和分子分型角度揭示云南省甲型副傷寒的流行規(guī)律和特點(diǎn)，為制定有針對(duì)性的防治措施提出依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 91株甲型副傷寒沙門菌均為2005-2012年間分離得到的菌株，其中玉溪市72株，紅河州14株，見表1。

表1 云南省2005-2012年 91株甲型副傷寒沙門菌菌株分布情況

1.2主要儀器 脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(Bio-Rad CHEF Mapper)，凝膠成像儀(Bio-Rad GEL Doc2000)。

1.3試劑XbaI和SpeI限制性內(nèi)切酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；SeaKem Gold Agarose購(gòu)自美國(guó) Cambraex Bio Rockland公司；藥敏紙片均購(gòu)于英國(guó)OXOID公司，按規(guī)定貯存并在有效期內(nèi)使用；M-H瓊脂，購(gòu)于北京陸橋生物科技公司。

1.4方法

1.4.1藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片法進(jìn)行，藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷根據(jù)按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)微生物敏感試驗(yàn)[1]執(zhí)行，試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。根據(jù)《全國(guó)傷寒副傷寒監(jiān)測(cè)方案》中提及的抗生素藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，主要選取10種抗生素，分別是：氨芐西林(AMP)、阿莫西林/棒酸(AMC)、頭孢噻吩(CFT)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、環(huán)丙沙星(CIP)、四環(huán)素(TBT)、利福平(RFA)和復(fù)方新諾明(SMZ)。

1.4.2脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE) 具體操作過程見參考文獻(xiàn)[2]，并按PulseNet公布的沙門菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)過程進(jìn)行操作和參數(shù)設(shè)置(Auto Algorithm：30 kb-low MW，700 kb-high MW，電泳時(shí)間為19 h)，每塊膠酶的用量為XbaI 45 U，SpeI 30 U(具有相同的XbaI酶切帶型的菌株再用SpeI進(jìn)行酶切)，37 ℃分別酶切2 h。電泳結(jié)束后用Gelred核酸染料染色30 min，純水脫色30 min，凝膠成像儀上讀取圖像。

1.4.3聚類分析 聚類分析采用BioNumerics V5.10軟件進(jìn)行聚類分析，應(yīng)用非加權(quán)組平均法(UPGMA)，聚類相似性系數(shù)采用基于條帶比較的Dice。Dice=2×N/(N+M)，N表示能匹配的條帶個(gè)數(shù)，M表示所有的條帶個(gè)數(shù)(2株菌帶型上的條帶數(shù)總和再減去匹配的條帶數(shù))。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果 2005-2012年間監(jiān)測(cè)的91株甲型副傷寒沙門菌株均對(duì)萘啶酸和利福平耐藥，而對(duì)阿莫西林/棒酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感；多重耐藥菌株則較少出現(xiàn)。各年間菌株的敏感性之間存在差異(χ2=58.414,P<0.01),表明近年來甲型副傷寒菌株對(duì)藥物的敏感性有所增加，見表2。

各地區(qū)菌株耐藥情況不盡相同，表現(xiàn)為玉溪市72株甲型副傷寒沙門菌株對(duì)萘啶酸和利福平耐藥，對(duì)阿莫西林/棒酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感；而紅河州的14株甲型副傷寒沙門菌株對(duì)萘啶酸、四環(huán)素、利福平耐藥；而對(duì)阿莫西林/棒酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感；德宏州的3株甲型副傷寒沙門菌對(duì)氨芐西林、萘啶酸、四環(huán)素、利福平藥，表現(xiàn)為多重耐藥；昆明市和曲靖市的各一株菌株也表現(xiàn)為多重耐藥，見表3。

2.2PFGE結(jié)果 91株甲型副傷寒沙門菌的XbaI酶切帶型主要分為兩個(gè)大的聚類群，如圖1所示。從圖中可以看出，云南省的玉溪市為甲型副傷寒的高發(fā)地區(qū)之一，并且不同年份的分離菌株具有相同的XbaI酶切帶型。除玉溪外，云南省的紅河、德宏等地區(qū)的分離菌株與玉溪的菌株也具有相同的XbaI酶切帶型。其中，2006-5是一株分離自曲靖市陸良縣的暴發(fā)疫情菌株，其帶型與監(jiān)測(cè)菌株具有較高的同源性關(guān)系，二者的相似度為96.5%。而2005-1是從健康體檢中分離出的一株甲型副傷寒沙門菌，其帶型與玉溪、紅河等地區(qū)的監(jiān)測(cè)菌株一致。

表2 云南省2005-2012年91株甲型副傷寒沙門菌各年藥敏結(jié)果

Note: * means Resistant; # means Intermediate; & means Susceptible.

表3 云南省2005-2012年各地區(qū)甲型副傷寒沙門菌株耐藥情況

Note: * means Resistant; # means Intermediate; & means Susceptible.

我們選取部分具有相同XbaI酶切帶型的代表性菌株用SpeI再次進(jìn)行PFGE電泳，以確認(rèn)菌株之間的同源性關(guān)系，如圖2所示。結(jié)果表明，雙酶切后菌株的分布關(guān)系與XbaI單個(gè)酶切的關(guān)系相一致，同樣分為了兩個(gè)聚類群，不同地區(qū)、年份的分離菌株雙酶切帶型具有一致性。

3 討 論

傷寒副傷寒是國(guó)家乙類法定傳染病。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展，全國(guó)以及云南省的傷寒副傷寒發(fā)病率呈逐年下降趨勢(shì)，但云南省的發(fā)病情況與全國(guó)相比位居首位，已成為云南省重要的公共衛(wèi)生問題。2011年全國(guó)7個(gè)省13個(gè)傷寒副傷寒監(jiān)測(cè)點(diǎn)中，云南省占2個(gè)。2011年《中國(guó)重點(diǎn)傳染病和病媒生物監(jiān)測(cè)報(bào)告》顯示，云南省勐海縣、云南省紅塔區(qū)的發(fā)病率最高(分別為48.67/10萬和49.42/10萬)。

以往由傷寒沙門菌引起的傷寒發(fā)病率較高，但近些年來，甲型副傷寒在全球的一些國(guó)家，如中國(guó)[3]、印度[4]、尼泊爾[5]、巴基斯坦[6]、臺(tái)灣[7]等地發(fā)病率逐年上升[8]，尤其是中國(guó)的一些地區(qū)[9]，副傷寒的發(fā)病率已經(jīng)超過了傷寒的發(fā)病率。

北美、歐洲尤其是東南亞地區(qū)近年甲型副傷寒暴發(fā)流行，故甲型副傷寒被列為近年重要的再發(fā)傳染病[10-14]。副傷寒的發(fā)病主要在東南亞地區(qū)，發(fā)病數(shù)約占到了所有傷寒病例的50%[15-17]，印度、新加坡從1996年，日本2000年出現(xiàn)了甲型副傷寒暴發(fā)[18-19]。中國(guó)從1998、1999年先后，在貴州、浙江、廣西、廣東等省都出現(xiàn)多起甲型副傷寒的暴發(fā)，在部分傷寒的傳統(tǒng)疫區(qū)甚至取代傷寒而成為優(yōu)勢(shì)菌型[20]。

圖12005-2012年云南省91株甲型副傷寒沙門菌PFGE-XbaI酶切結(jié)果

Fig.1DistributiononPFGEpatternsof91SalmonellaparatyphiAstrainsisolatedinYunnanProvincedigestedbyXbaI,2005-2012

圖2XbaI和SpeI雙酶切帶型相同的菌株P(guān)FGE結(jié)果

Fig.2DoubleenzymedigestionofXbaIandSpeIonthesamestrainpatternsofPFGE

近年來云南省成為全國(guó)甲型副傷寒沙門菌流行的高發(fā)地區(qū)，而玉溪市又是云南省副傷寒主要流行的地區(qū)。1999年以來，玉溪市是中國(guó)最嚴(yán)重的甲型副傷寒疫病區(qū)[21]。

對(duì)91株甲型副傷寒沙門菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，云南省的甲型副傷寒沙門菌對(duì)萘啶酸和利福平耐藥，而對(duì)阿莫西林/棒酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感；僅有較少數(shù)量的菌株出現(xiàn)多重耐藥情況。張瑩[22]等對(duì)2006-2008年云南省傷寒、副傷寒監(jiān)測(cè)點(diǎn)(紅塔區(qū)和澄江縣)分離的部分甲型副傷寒菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示甲型副傷寒對(duì)氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素等大多數(shù)抗生素普遍敏感，對(duì)利福平、萘啶酸耐藥，與本研究的結(jié)果一致。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)具有對(duì)細(xì)菌整個(gè)染色體進(jìn)行分析，重復(fù)性好，區(qū)分能力強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定且更易解釋，被推薦為多種致病菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)[23]。而用XbaI 酶切的甲型副傷寒PFGE 分辨率最高，具有最大區(qū)分能力的電泳參數(shù),XbaI PFGE在顯示多個(gè)克隆變異方面有較高的分辨力[24-25]，而SpeI PFGE 是把真正克隆區(qū)分開來的一種堅(jiān)實(shí)手段并能用于檢測(cè)克隆內(nèi)的微進(jìn)化[26]。

從91株甲型副傷寒沙門菌的PFGE結(jié)果可以看出云南省的副傷寒形成了兩個(gè)高度分化的克隆群菌株。李偉[2]等的研究發(fā)現(xiàn)，甲型副傷寒大部分屬于高度相似的克隆系，在不同省份、不同年代廣泛存在。張?chǎng)┫糩27]等的研究也發(fā)現(xiàn)甲型副傷寒間有較高的同源性。伏曉慶[28]等對(duì)國(guó)家傷寒副傷寒防治示范基地項(xiàng)目獲得的玉溪市212株甲型副傷寒用XbaI進(jìn)行酶切，發(fā)現(xiàn)其變異不大，有可能是同一克隆系的甲型副傷寒沙門菌。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了甲型副傷寒沙門菌變異性不大等特點(diǎn)。

2008-2010年，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心在云南省玉溪市開展傷寒副傷寒防治示范基地項(xiàng)目，通過建立基于全人群的發(fā)熱癥狀監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，開展傷寒副傷寒病例對(duì)照調(diào)查和實(shí)施綜合干預(yù)措施，使該地區(qū)發(fā)病水平得到一定控制。但從本研究的結(jié)果仍然可以看出，云南省玉溪市仍然存在甲型副傷寒的流行。而且從PFGE的結(jié)果可以推斷云南省不同地區(qū)的甲型副傷寒流行可能具有相似的傳播途徑的特點(diǎn)，可能是由某個(gè)區(qū)域的菌株不斷擴(kuò)散傳播出去，形成了兩個(gè)高度分化的克隆群菌株[29]，從各地監(jiān)測(cè)菌株的分子分型結(jié)果可以看出這一點(diǎn)。基于這些研究結(jié)果，我們認(rèn)為目前云南省傷寒副傷寒菌株的傳播途徑和機(jī)制仍然還未得到有效控制，還需針對(duì)傷寒副傷寒高發(fā)地區(qū)進(jìn)行高危因素防控工作。

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