王金水，周 陽(yáng)，藺丹華

（河南工業(yè)大學(xué) 1.生物工程學(xué)院；2.糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

花生屬于八大類食物過(guò)敏原之一，影響人群廣泛.美國(guó)有1.4%的兒童對(duì)花生過(guò)敏；加拿大超過(guò)1%的兒童對(duì)花生過(guò)敏；新加坡14～16 歲本地學(xué)生中，有0.47%的人對(duì)花生過(guò)敏[1-3].花生過(guò)敏不但影響人群數(shù)量多，而且對(duì)患者有很大的傷害性，可引發(fā)致死反應(yīng)，美國(guó)每年100～200 人死于花生過(guò)敏.花生過(guò)敏一般伴隨終身，且不能通過(guò)采取食物回避措施完全避免[4].因此解決花生過(guò)敏問(wèn)題有著重要的意義.

現(xiàn)在被國(guó)際免疫學(xué)會(huì)（IUIS）下屬的致敏原命名分會(huì)認(rèn)可的花生過(guò)敏原共有13 種（Ara h 1 到Ara h 13）[5].雖然現(xiàn)在還沒有解決這一問(wèn)題的可行手段，但是已出現(xiàn)了很多很有希望的方法.醫(yī)療上的方法有口服免疫脫敏.

降低致敏性的方法有：傳統(tǒng)育種、輻照育種、基因工程、高壓蒸汽法、輻照法、鞣酸法，磁性球抓取法、酶處理法、發(fā)酵法等[6-9].在這些方法中，發(fā)酵具有溫和、自然、一般不產(chǎn)生有害物的特點(diǎn).相比基因工程、輻照等方法，發(fā)酵法不存在食品安全方面的擔(dān)憂；相比高壓蒸汽法、酶處理法，發(fā)酵更為廉價(jià)；相比鞣酸法等方法，發(fā)酵一般不會(huì)降低產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，反而很可能增加產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)并帶來(lái)怡人的風(fēng)味.因此，發(fā)酵法是降低花生制品致敏性的一種非常有希望的方法.

作者嘗試用一種益生菌（枯草芽孢桿菌）對(duì)低溫壓榨花生粕進(jìn)行發(fā)酵，探索其發(fā)酵降低花生蛋白致敏性的效果及規(guī)律.

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌：河南工業(yè)大學(xué)9431 實(shí)驗(yàn)室保藏.

冷榨花生蛋白粉：德州宏鑫花生蛋白食品有限公司.

平板分離培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g冷榨花生蛋白粉，150 mL 蒸餾水，0.75 g NaCl，攪拌均勻后121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min.

1.2 主要儀器

KDN-08C 凱氏定氮儀：上海新嘉電子有限公司；THZ-300 恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；V-GES 垂直凝膠電泳系統(tǒng)：Wealtec Corp；HP Scanjet G4010 掃描儀：惠普研發(fā)有限合伙公司.

1.3 發(fā)酵工藝

將保存的菌種在平面培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)2 次（均培養(yǎng)21 h 至對(duì)數(shù)期）；選取生長(zhǎng)旺盛的單菌落在種子培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min 下擴(kuò)大培養(yǎng)9 h至對(duì)數(shù)期；將制成的種子液按5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min 下分別發(fā)酵8、16、24、32、36、40、44、48、50、52 h.發(fā)酵后 的樣 品立即冷凍干燥以作日后分析.

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 總蛋白含量測(cè)定

參照GB/T 5009.5—2010 凱氏定氮法.

1.4.2 水溶性蛋白含量測(cè)定

稱取5 g 樣品，加入75 mL 蒸餾水，攪拌30 min，2 000 r/min 下離心20 min，取上清液，根據(jù)GB/T 5009.5—2010 進(jìn)行原料的水溶性蛋白含量測(cè)定，另加入0.25 g NaCl.

1.4.3 pH 值測(cè)定

（1）發(fā)酵樣品pH 測(cè)定：混勻后，倒取約50 mL 發(fā)酵液，測(cè)定pH 值.

（2）原料pH 測(cè)定：稱取5 g 原料，加入75 mL蒸餾水、0.25 g NaCl，混勻后，測(cè)定pH 值.

1.4.4 水解度的測(cè)定

甲醛滴定法測(cè)定氨基氮含量：發(fā)酵樣品以2 000 r/min 離心20 min，取上清液5 mL，加入60 mL 蒸餾水，用0.1 moL/L 標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液滴定至pH 8.2，再加入20 mL pH 8.2 的中性甲醛溶液，繼續(xù)用0.05 moL/L 標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液滴定至pH 9.2，記錄加入甲醛后消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液體積，同時(shí)作空白對(duì)照.

式中：V1為樣品消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液的體積，mL；V2為空白消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液的體積，mL；c1為標(biāo)準(zhǔn)NaOH 的濃度，mol/L；c2為樣品的總蛋白濃度，g/mL；htot為1 g 花生蛋白所含的肽鍵總數(shù)7.13 mmol/g.

1.4.5 過(guò)敏原含量分析

4%濃縮膠，15%分離膠，膠板尺寸9 cm×9 cm；混合樣品與樣品緩沖液（包含甘油、SDS、β-巰基乙醇的Tris 緩沖液，pH 6.8），每個(gè)混合后的溶液蛋白濃度達(dá)到1.26 mg/mL，沸水浴處理10 min.冷卻至室溫，用處理后的樣品溶液5 μL 上樣（每個(gè)樣品含蛋白6.3 μg）；用純化的花生過(guò)敏原Ara h 1 和Ara h 2 做參照；垂直電泳：Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)，145 V，30 mA，60 min；考馬斯亮藍(lán)R-250 染色4 h，脫色后用HP Scanjet G4010 掃描儀掃描成像.

1.4.6 感官評(píng)價(jià)

選取20 名嗅覺正常的人員，對(duì)原料及發(fā)酵樣品進(jìn)行顏色和氣味的感官描述并給出感官評(píng)分（滿分10 分）.排除異常分?jǐn)?shù)后，對(duì)其余分?jǐn)?shù)求平均值，作為某一發(fā)酵樣品的感官得分.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對(duì)樣品基本理化指標(biāo)和代謝的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)樣品總蛋白含量和水溶性蛋白含量的影響如圖1 所示.

由圖1 可以看出，高壓蒸汽滅菌處理對(duì)樣品的總蛋白含量沒有影響，但是隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，樣品總蛋白含量呈線性上升，但總體增幅很小（發(fā)酵52 h，樣品總蛋白含量為32.85 mg/mL，相比原料增加了16%）.根據(jù)物質(zhì)守恒原理，樣品總蛋白含量的上升不可能是微生物本身的繁殖造成的，應(yīng)該是由發(fā)酵過(guò)程中的水分遺失引起的.綜合微生物發(fā)酵的一般規(guī)律和試驗(yàn)結(jié)果，枯草芽孢桿菌發(fā)酵對(duì)原料的總蛋白含量影響不大.

高壓蒸汽滅菌處理稍微增加了樣品的水溶性蛋白含量（增加量12.5%），而發(fā)酵顯著持續(xù)地增加了樣品的水溶性蛋白含量.發(fā)酵8 h，樣品水溶性蛋白含量為10.89 mg/mL，為原料的1.57 倍；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其含量持續(xù)增加，發(fā)酵52 h，達(dá)到15.14 mg/mL，為原料的2.57 倍；水溶性蛋白增加的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了水分遺失的速度.所以枯草芽孢桿菌發(fā)酵可以顯著增加樣品的水溶性蛋白含量.

發(fā)酵時(shí)間對(duì)樣品水解度和pH 值的影響如圖2所示.

由圖2 可以看出，高壓滅菌處理對(duì)樣品的水解度沒有影響；然而隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，樣品的水解度越來(lái)越高.原料的水解度只有3.0%，而發(fā)酵44 h 時(shí)水解度可以達(dá)到13.4%，這表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵可以顯著增加樣品的水解度.縱觀整條曲線，水解度的變化經(jīng)歷了3 個(gè)階段：0～16 h，水解度幾乎保持不變；16～44 h，水解度呈指數(shù)快速增加；44～52 h，水解度趨于穩(wěn)定.這一現(xiàn)象可能是由微生物的生長(zhǎng)特性導(dǎo)致的.0～16 h，菌種處于生長(zhǎng)的延滯期，代謝相對(duì)對(duì)數(shù)期較弱，對(duì)樣品的水解度影響很??；16～44 h，菌種處于生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，代謝旺盛，水解度快速增加；44～52 h，菌種處于生長(zhǎng)的穩(wěn)定期或衰亡期，代謝能力下降，對(duì)樣品水解度的影響又變得微弱.

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)樣品總蛋白含量和水溶性蛋白含量的影響

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)樣品水解度和pH 值的影響

高壓蒸汽滅菌處理對(duì)樣品的pH 值影響不大；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，樣品pH 值整體呈下降趨勢(shì).0～16 h，樣品pH 幾乎不變，略有下降；16～32 h，樣品pH 快速下降；32～52 h，樣品pH 繼續(xù)下降且趨于平緩.

2.2 發(fā)酵對(duì)樣品蛋白組成的影響

原料及發(fā)酵樣品的SDS-PAGE 如圖3 所示.

圖3 原料及發(fā)酵樣品的SDS-PAGE

由圖3 可以看出，與原料泳道相比，高壓蒸汽滅菌后的泳道總體色澤和高分子區(qū)色澤明顯降低，發(fā)酵后的樣品泳道總體色澤和高分子區(qū)色澤則進(jìn)一步降低，這表明高壓滅菌處理可以造成原料亞基的大幅度降解，對(duì)高分子亞基也有著很強(qiáng)的降解作用，而發(fā)酵則進(jìn)一步深化了該降解過(guò)程.

觀察Ara h 1 條帶區(qū)發(fā)現(xiàn)：高壓滅菌處理能夠大幅度降低Ara h 1 的含量，發(fā)酵能繼續(xù)降低Ara h 1 的含量.發(fā)酵8 h，Ara h 1 的含量進(jìn)一步下降；發(fā)酵16 h 以后，Ara h 1 條帶幾乎消失（補(bǔ)充說(shuō)明：由于在高壓滅菌和發(fā)酵過(guò)程中，其他蛋白質(zhì)可能降解產(chǎn)生與Ara h 1 亞基分子質(zhì)量相似的亞基，所以除原料泳道外，其他泳道的Ara h 1 含量可能低于該泳道Ara h 1 條帶區(qū)的蛋白含量）.

觀察Ara h 2 條帶區(qū)發(fā)現(xiàn)：高壓滅菌及發(fā)酵后，Ara h 2 條帶區(qū)的蛋白含量或增加或減少，變化沒有規(guī)律性且變化幅度很大.出現(xiàn)上述情況的原因是：試驗(yàn)采用的花生蛋白中，分子質(zhì)量高于Ara h 1 亞基（63.5 ku）的蛋白亞基含量很低，因此Ara h 1 條帶區(qū)受到其他蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物的影響很??；但是Ara h 2 的分子質(zhì)量相對(duì)較?。?6～17 ku），且分子質(zhì)量高于Ara h 2 的亞基含量很高且降解充分，所以Ara h 2 條帶區(qū)受到其他亞基降解產(chǎn)物的影響很大.考慮到微生物降解一般不會(huì)再產(chǎn)生Ara h 2，所以如果Ara h 2 條帶區(qū)蛋白含量降低，該泳道Ara h 2 的含量一定至少發(fā)生該幅度的降低；Ara h 2 條帶區(qū)蛋白含量增高，該泳道Ara h 2 的含量并沒有增多，應(yīng)該是由分子質(zhì)量更大的亞基降解的結(jié)果.所以，發(fā)酵可以降低Ara h 2 的含量，發(fā)酵至多36 h，Ara h 2 的含量已顯著下降.

綜上，高壓滅菌處理和繼續(xù)發(fā)酵能顯著降低Ara h 1 和Ara h 2 的含量.又由于高壓滅菌處理和繼續(xù)發(fā)酵對(duì)花生蛋白有著很好的降解效果，發(fā)酵還可以顯著增加樣品的水可溶性蛋白含量及水解度.因此，高壓滅菌處理加繼續(xù)發(fā)酵很可能降低Ara h 1 和Ara h 2 的致敏性.由于Ara h 1 和Ara h 2 是常用的衡量花生產(chǎn)品致敏性的標(biāo)志，因此在試驗(yàn)條件下的枯草芽孢桿菌發(fā)酵很可能能夠降低花生蛋白的致敏性.

2.3 感官評(píng)價(jià)（表1）

由表1 可知，高壓蒸汽滅菌和發(fā)酵0～8 h，樣品的感官特性沒有明顯變化，容易被消費(fèi)者接受.發(fā)酵16～32 h，樣品除了保持原有的花生醇香，色澤還發(fā)生了誘人的變化并且開始出現(xiàn)令人舒服的微酸味，是消費(fèi)者最樂(lè)于接受的階段.發(fā)酵36～44 h，樣品逐漸產(chǎn)生腥味和臭味，花生香味開始減弱，酸味開始增強(qiáng)，顏色逐漸變?yōu)樽厣?，但總體上還尚可接受.發(fā)酵48 h 以后，樣品產(chǎn)生濃酸味，逐漸產(chǎn)生很濃的腥臭味，花生香味逐漸消失，色澤變?yōu)樯钭厣?，整體上已經(jīng)無(wú)法讓消費(fèi)者接受.因此，感官評(píng)價(jià)最好的是發(fā)酵16～32 h.

2.4 綜合評(píng)價(jià)

綜合總蛋白含量、水溶性蛋白含量、致敏性、感官評(píng)價(jià)4 個(gè)指標(biāo)對(duì)發(fā)酵樣品及原料進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).總蛋白含量可視為基本一致；致敏性方面，發(fā)酵16 h 以后可以視為一致；水溶性蛋白含量上，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加；感官評(píng)價(jià)方面，發(fā)酵16～32 h 最好.因?yàn)槭称返母泄偬匦杂葹橹匾钟捎诎l(fā)酵16～32 h，水溶性蛋白已經(jīng)達(dá)到很高的水平，所以相比水溶性蛋白含量，應(yīng)該把感官評(píng)價(jià)作為優(yōu)先考慮的因素.因此，確定發(fā)酵最優(yōu)時(shí)間為

16～32 h.

3 結(jié)論

作者研究了枯草芽孢桿菌發(fā)酵對(duì)花生蛋白致敏性及產(chǎn)品特性的影響.研究發(fā)現(xiàn)，高壓蒸汽滅菌對(duì)原料的總蛋白含量、水溶性蛋白含量、水解度、pH 值、感官評(píng)價(jià)均無(wú)影響；但可以顯著降低Ara h 1 和Ara h 2 的含量.枯草芽孢桿菌繼續(xù)發(fā)酵，對(duì)樣品的總蛋白含量幾乎無(wú)影響，但可以顯著增加樣品的水溶性蛋白含量和水解度，讓樣品pH 值降低并趨于穩(wěn)定，幾乎清除Ara h 1，進(jìn)一步明顯降低Ara h 2，很可能降低樣品的致敏性，并且對(duì)樣品的感官特性產(chǎn)生顯著影響（更加怡人到不可接受）.綜合評(píng)價(jià)，本試驗(yàn)條件下發(fā)酵的最優(yōu)時(shí)間為16～32 h.

4 展望

總體來(lái)說(shuō)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵基本不影響樣品的總蛋白含量，但可以顯著增加樣品的水溶性蛋白含量，大幅度提高水解度，很有可能能夠降低樣品的致敏性，并且還可以增加樣品的風(fēng)味和色澤，有可能是一種降低花生蛋白致敏性的有效方法.

但本研究只是對(duì)該問(wèn)題的初步探索，可望在后續(xù)研究中進(jìn)行ELISA 檢測(cè)及動(dòng)物過(guò)敏試驗(yàn)以驗(yàn)證枯草芽孢桿菌發(fā)酵在降低花生蛋白致敏性方面的作用.此外，還應(yīng)對(duì)產(chǎn)品特性的變化機(jī)理進(jìn)行研究，并對(duì)產(chǎn)品的其他特性（如功能肽含量、乳化性、起泡性等）進(jìn)行測(cè)定以便達(dá)到更全面的評(píng)價(jià)枯草芽孢桿菌發(fā)酵的效果.

［1］Sicherer S H，Munoz-Furlong A，Godbold J H，et al.US prevalence of self-reported peanut，tree nut，and sesame allergy:11-year followup［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2010，125（6）:1322-1326.

［2］Ben-Shoshan M，Kagan R S，Alizadehfar R，et al.Is the prevalence of peanut allergy increasing？A 5-year follow-up study in children in Montreal［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2009，123（4）:783-788.

［3］Shek L P，Cabrera-Morales E A，Soh S E，et al.A population-based questionnaire survey on the prevalence of peanut，tree nut，and shellfish allergy in 2 Asian populations［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2010，126（2）:324-331.

［4］King R M，Knibb R C，Hourihane J O.Impact of peanut allergy on quality of life，stress and anxiety in the family［J］.Allergy，2009，64（3）：461-468.

［5］IUIS Allergen Nomenclature Sub -Committee.Search results of peanut allergens［DB/OL］.（2013 -06 -04）［2013 -06 -30］.http://www.allergen.org/search.php?Allergensource=Arachis+hypogaea.

［6］Chu Y，F(xiàn)austinelli P，Ramos M L，et al.Reduction of IgE binding and nonpromotion of Aspergillus flavus fungal growth by simultan -eously silencing Ara h 2 and Ara h 6 in peanut［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（23）:11225-11233.

［7］Chung S Y，Champagne E T.Using magnetic beads to reduce peanut allergens from peanut extracts［J］.Journal of Allergy Clinical Immunology，2010，125（2）:AB223.

［8］Cabanillas B，Maleki S J，Rodrguez J，et al.Heat and pressure treatments effects on peanut allergenicity［J］.Food Chemistry，2012，132（1）:360-366.

［9］Ahmedna M，Yu J M，Goktepe I.Process for preparing hypoallergenic and non -allergenic peanut butter and associated products:USA，US2010/0080870 A1［P］.2010-04-01.