王正元，惠 明*，尚小利，田 青，侯銀臣

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.鄭州市中食農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，河南 鄭州 450001）

0 引言

小米是我國主要谷物食糧之一，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位.小米中富含人體所需的多種營養(yǎng)成分，其蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)含量均高于大米和玉米[1]，且各組分比例適中，易于消化.黃酒主要是以稻米為原料，釀造而成的酒性醇和、酒精度低、營養(yǎng)豐富的原汁酒，是國家提倡發(fā)展的飲料酒之一[2].以小米為黃酒釀造原料，增加了小米資源的利用開發(fā).目前，大多數(shù)黃酒企業(yè)仍采用傳統(tǒng)的釀造工藝，成品酒批次間質(zhì)量不穩(wěn)定等因素嚴(yán)重影響了黃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3].筆者采用α-淀粉酶、糖化酶進(jìn)行蒸煮后小米淀粉的液化和糖化代替?zhèn)鹘y(tǒng)釀造工藝中不穩(wěn)定的拌曲階段，可明顯縮短發(fā)酵周期，減少發(fā)酵階段的雜菌生長，降低成品酒批次間的不穩(wěn)定因素.

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母：安琪釀酒活性干酵母；小米：市售；α-淀粉酶：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，固體，3 700 U/g；糖化酶：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，固體，10 000 U/g；3，5-二硝基水楊酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純.

1.2 主要設(shè)備

723N 可見光分光光度計(jì)、PHS-3E 型pH 計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：河南智誠科技發(fā)展有限公司；SW-CJ-1G 型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；THZ-300C 恒溫培養(yǎng)搖床、DHP-9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；酒精度計(jì)：北京石景山玻璃儀器廠.

1.3 工藝流程

洗米→浸米→蒸煮→α-淀粉酶液化→糖化酶糖化→發(fā)酵→壓榨過濾→殺菌→灌裝→殺菌→成品.

1.4 測定方法

還原糖的測定：3，5-二硝基水楊酸比色定糖（DNS）法[4].

總酸的測定[5]：酸堿滴定法，指示劑為酚酞.

酒精度的測定方法[6]：容量法.

干基的測定[7]：直接恒質(zhì)量法.

1.5 工藝操作要點(diǎn)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 浸米[8]與蒸飯[9]

小米浸泡24 h，浸米溫度為20.0 ℃.蒸煮前，先將空甑蒸5～6 min，然后傾入浸泡過的小米，待冒汽后，加蓋蒸煮，開始計(jì)算蒸米時(shí)間.

1.5.2 液化條件的選擇

稱取定量的蒸煮過的小米，按20 U/g 加入α-淀粉酶（酶活力3 700 U/g），混合均勻，每隔40 min 取樣測定還原糖含量，以確定最佳液化時(shí)間.

按8、16、24、32、40 U/g 的添加量添加α-淀粉酶，在最佳液化時(shí)間時(shí)取樣檢測還原糖的含量以確定最佳酶添加量.

將蒸煮過的小米分別在75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃下保溫后，添加α-淀粉酶以考察溫度對(duì)液化液還原糖含量的影響.

將蒸煮后的小米保溫至最佳液化溫度，用HCl和NaOH 分別調(diào)整pH 值為3、4、5、6、7，添加α-淀粉酶混合均勻，檢測還原糖含量以確定最佳液化pH 值.

1.5.3 糖化條件的選擇

按照最佳液化條件液化結(jié)束后，添加適量的糖化酶在65 ℃條件下糖化35 h，每隔5 h 取樣一次，并測定其還原糖含量，確定最佳糖化時(shí)間.

按110、130、150、170、190 U/g 的酶添加量往液化后的小米中添加糖化酶（酶活力10 000 U/g），考察糖化酶添加量對(duì)糖化結(jié)果的影響.

取樣分別保溫至50、55、60、65、70 ℃后，添加糖化酶以考察溫度對(duì)糖化結(jié)果的影響.

用HCl 和NaOH 將pH 值調(diào)整為3、4、5、6、7，添加糖化酶并混勻，通過檢測還原糖含量確定最佳糖化pH 值.

1.5.4 酒母的制備

將小米糖化后過濾，取其濾液分裝于三角瓶中，加入鹽酸調(diào)pH 至4.5，蒸汽滅菌20 min，冷卻至28 ℃，用于活性干酵母活化，活化時(shí)間為15 min.

1.5.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)的方法分別考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度，活性干酵母添加量和蒸米時(shí)間對(duì)發(fā)酵完成后壓榨過濾的濾液中還原糖含量、總酸含量、酒精度的影響，然后采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化.

2 結(jié)果與分析

2.1 小米淀粉液化糖化工藝條件的確定

由圖1 可知，在液化和糖化過程中，隨著酶解時(shí)間的延長，水解液DE 值逐漸增大，之后趨于穩(wěn)定.在小米淀粉液化和糖化過程中，液化180 min和糖化25 h 內(nèi)，酶解液DE 值增加較快，之后增加緩慢趨于穩(wěn)定.為了節(jié)約時(shí)間以提高效率，確定液化時(shí)間為180 min，此時(shí)液化DE 值為18.61%；糖化時(shí)間為25 h，此時(shí)糖化DE 值為43.01%.

圖1 液化時(shí)間對(duì)小米液化和糖化的影響

由圖2 可知，隨著α-淀粉酶和糖化酶添加量的增加，DE 值迅速升高；但當(dāng)α-淀粉酶添加量大于32 U/g，糖化酶添加量大于150 U/g 時(shí)，DE 值基本趨于穩(wěn)定.這是由于加酶量較小時(shí)，底物質(zhì)量濃度大于酶的質(zhì)量濃度，加酶量對(duì)反應(yīng)速率的影響較大，DE 值隨著加酶量的增加而快速增大；隨著加酶濃度逐漸增大，酶促反應(yīng)速率受底物濃度的制約，致使水解液DE 值基本不變.考慮到成本因素，32 U/g 為α-淀粉酶較優(yōu)的加酶量，150 U/g 為糖化酶較優(yōu)的加酶量.

圖2 酶添加量對(duì)小米液化和糖化的影響

由圖3 可知，水解液DE 值隨溫度升高先增大后減少，液化溫度為80 ℃時(shí)液化液DE 值最大，可達(dá)17.38%；糖化溫度為60 ℃時(shí)最終糖化液DE 值最高，可達(dá)45.6%.酶解溫度同時(shí)影響酶促反應(yīng)速率和酶的活性，當(dāng)溫度較低時(shí)，隨酶解溫度的升高，酶促反應(yīng)速率加快；而當(dāng)溫度超過最適溫度時(shí)，隨溫度的繼續(xù)升高，酶變性失活，酶促反應(yīng)速率迅速下降.因此，液化的較優(yōu)溫度在80 ℃左右，糖化的較優(yōu)溫度在60 ℃左右.

由圖4 可知，水解液DE 值隨著pH 值的增大而先升高后降低，液化和糖化階段最適pH 值都在6 左右，即蒸煮后小米在自然狀態(tài)下酶解液DE 值最大，液化時(shí)DE 值達(dá)到16.81%，糖化時(shí)DE 值達(dá)到39.6%.pH 值會(huì)影響極性基團(tuán)和酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性，從而影響酶分子中活性基團(tuán)的構(gòu)象以及與底物的結(jié)合力和催化能力.α-淀粉酶和糖化酶在最適作用pH 值范圍內(nèi)才能很好地發(fā)揮作用.水解液過堿或過酸都會(huì)影響其穩(wěn)定性，導(dǎo)致酶活性降低，影響酶解速率.

圖3 溫度對(duì)小米液化和糖化的影響

圖4 pH 對(duì)小米液化和糖化的影響

2.2 發(fā)酵工藝參數(shù)的確定

2.2.1 發(fā)酵過程單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖5 可知，隨蒸米時(shí)間的增加，發(fā)酵結(jié)束后濾液的酸度、酒精度和還原糖含量都呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢.蒸米時(shí)間過短，則造成液化糖化后還原糖含量低，影響后續(xù)酵母的繁殖，蒸米時(shí)間過長則造成能源資源的浪費(fèi)，因此確定小米的蒸煮時(shí)間為40 min.

圖5 蒸米時(shí)間對(duì)酒質(zhì)的影響

由圖6 可知，發(fā)酵溫度過高，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其濾液的總酸含量較高，當(dāng)發(fā)酵溫度為32 ℃，濾液的總酸含量為0.6 g/100 mL.發(fā)酵溫度較低時(shí)，酵母新陳代謝減慢，增殖緩慢，酵母消耗還原糖和產(chǎn)酒精量較少.因此，確定發(fā)酵溫度為28 ℃.

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)酒質(zhì)的影響

由圖7 可知，隨發(fā)酵時(shí)間的延長，在4 d 內(nèi)濾液中的總酸含量和酒精度都增加較快，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5 d 時(shí)，酒精度含量有所降低，總酸含量增加.從黃酒酒質(zhì)要求酒精度較高、酸度和還原糖含量適宜的角度，確定黃酒發(fā)酵時(shí)間為4 d.

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒質(zhì)的影響

由圖8 可知，酵母添加量較少時(shí)，發(fā)酵緩慢，濾液中酒精度較低，隨酵母添加量的增加，濾液中酒精含量逐漸增高，從圖8 可知，當(dāng)酵母添加量超過0.2‰，由于酵母添加量較多，其繁殖消耗的還原糖含量增加，造成還原糖轉(zhuǎn)化為酒精含量減少，所以酒精度有所降低.因此，確定活性干酵母的添加量為0.2‰.

2.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化（表1、表2）

試驗(yàn)表明：影響黃酒發(fā)酵質(zhì)量的主要因素是發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間.各因素對(duì)還原糖含量影響的主次順序?yàn)椋篈＞B＞D＞C；各因素對(duì)總酸含量影響的主次順序?yàn)椋築＞A＞D＞C；各因素對(duì)酒精度影響的主次順序?yàn)锳＞D＞B＞C.溫度對(duì)還原糖含量、總酸含量和酒精度的影響均顯著，發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸度含量的影響顯著.因此，從還原糖含量、總酸含量、酒精度及節(jié)能方面考慮，確定小米黃酒的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵時(shí)間4 d，發(fā)酵溫度28 ℃，酵母添加量0.2‰，最佳蒸米時(shí)間40 min.

圖8 酵母添加量對(duì)酒質(zhì)的影響

3 結(jié)論

在傳統(tǒng)工藝制曲拌曲過程中，若制曲不當(dāng)，生曲、燒曲的現(xiàn)象可能導(dǎo)致黃酒發(fā)酵“酸敗”，拌曲時(shí)不只有糖化菌的存在還可引入其他腐敗類產(chǎn)酸菌，影響酒質(zhì)和口感[10-11].試驗(yàn)中用α-淀粉酶液化淀粉、糖化酶糖化淀粉明顯減少了雜菌的生長，同時(shí)也消除了雜菌帶給黃酒批次間的不穩(wěn)定因素.控制合適的蒸米時(shí)間，是發(fā)酵原料處理的關(guān)鍵，若蒸米時(shí)間過短，有硬心現(xiàn)象的出現(xiàn)，則造成后續(xù)液化糖化階段酶解困難，從而影響后續(xù)的酵母發(fā)酵.在小米液化過程中選擇合適的溫度和酶添加量對(duì)還原糖總量的影響較為重要，糖化過程中除了選擇合適的溫度外還應(yīng)注意選擇合適的糖化時(shí)間，以滿足后續(xù)酵母的發(fā)酵所需的總還原糖含量.因此，確定蒸米時(shí)間為40 min，小米的液化時(shí)間為180 min，液化溫度為80 ℃，液化pH 為6.0，α-淀粉酶添加量為32 U/g；糖化時(shí)間為25 h，糖化溫度為60 ℃，糖化pH 為6.0，糖化酶添加量為150 U/g.在酵母發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度和時(shí)間是形成酒質(zhì)口感的關(guān)鍵因素，溫度過高黃酒酸敗的可能性增加，發(fā)酵時(shí)間過長也將導(dǎo)致總酸含量的增加、酒精度的降低.因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為4 d，發(fā)酵溫度為28 ℃.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)方差分析

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