王正元,惠 明*,尚小利,田 青,侯銀臣
(1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.鄭州市中食農(nóng)產(chǎn)品加工研究院,河南 鄭州 450001)
小米是我國主要谷物食糧之一,種植面積和產(chǎn)量均居世界首位.小米中富含人體所需的多種營養(yǎng)成分,其蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)含量均高于大米和玉米[1],且各組分比例適中,易于消化.黃酒主要是以稻米為原料,釀造而成的酒性醇和、酒精度低、營養(yǎng)豐富的原汁酒,是國家提倡發(fā)展的飲料酒之一[2].以小米為黃酒釀造原料,增加了小米資源的利用開發(fā).目前,大多數(shù)黃酒企業(yè)仍采用傳統(tǒng)的釀造工藝,成品酒批次間質(zhì)量不穩(wěn)定等因素嚴(yán)重影響了黃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3].筆者采用α-淀粉酶、糖化酶進(jìn)行蒸煮后小米淀粉的液化和糖化代替?zhèn)鹘y(tǒng)釀造工藝中不穩(wěn)定的拌曲階段,可明顯縮短發(fā)酵周期,減少發(fā)酵階段的雜菌生長,降低成品酒批次間的不穩(wěn)定因素.
釀酒酵母:安琪釀酒活性干酵母;小米:市售;α-淀粉酶:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,固體,3 700 U/g;糖化酶:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,固體,10 000 U/g;3,5-二硝基水楊酸:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,化學(xué)純.
723N 可見光分光光度計(jì)、PHS-3E 型pH 計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋:河南智誠科技發(fā)展有限公司;SW-CJ-1G 型單人凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司;THZ-300C 恒溫培養(yǎng)搖床、DHP-9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司;酒精度計(jì):北京石景山玻璃儀器廠.
洗米→浸米→蒸煮→α-淀粉酶液化→糖化酶糖化→發(fā)酵→壓榨過濾→殺菌→灌裝→殺菌→成品.
還原糖的測定:3,5-二硝基水楊酸比色定糖(DNS)法[4].
總酸的測定[5]:酸堿滴定法,指示劑為酚酞.
酒精度的測定方法[6]:容量法.
干基的測定[7]:直接恒質(zhì)量法.
1.5.1 浸米[8]與蒸飯[9]
小米浸泡24 h,浸米溫度為20.0 ℃.蒸煮前,先將空甑蒸5~6 min,然后傾入浸泡過的小米,待冒汽后,加蓋蒸煮,開始計(jì)算蒸米時(shí)間.
1.5.2 液化條件的選擇
稱取定量的蒸煮過的小米,按20 U/g 加入α-淀粉酶(酶活力3 700 U/g),混合均勻,每隔40 min 取樣測定還原糖含量,以確定最佳液化時(shí)間.
按8、16、24、32、40 U/g 的添加量添加α-淀粉酶,在最佳液化時(shí)間時(shí)取樣檢測還原糖的含量以確定最佳酶添加量.
將蒸煮過的小米分別在75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃下保溫后,添加α-淀粉酶以考察溫度對(duì)液化液還原糖含量的影響.
將蒸煮后的小米保溫至最佳液化溫度,用HCl和NaOH 分別調(diào)整pH 值為3、4、5、6、7,添加α-淀粉酶混合均勻,檢測還原糖含量以確定最佳液化pH 值.
1.5.3 糖化條件的選擇
按照最佳液化條件液化結(jié)束后,添加適量的糖化酶在65 ℃條件下糖化35 h,每隔5 h 取樣一次,并測定其還原糖含量,確定最佳糖化時(shí)間.
按110、130、150、170、190 U/g 的酶添加量往液化后的小米中添加糖化酶(酶活力10 000 U/g),考察糖化酶添加量對(duì)糖化結(jié)果的影響.
取樣分別保溫至50、55、60、65、70 ℃后,添加糖化酶以考察溫度對(duì)糖化結(jié)果的影響.
用HCl 和NaOH 將pH 值調(diào)整為3、4、5、6、7,添加糖化酶并混勻,通過檢測還原糖含量確定最佳糖化pH 值.
1.5.4 酒母的制備
將小米糖化后過濾,取其濾液分裝于三角瓶中,加入鹽酸調(diào)pH 至4.5,蒸汽滅菌20 min,冷卻至28 ℃,用于活性干酵母活化,活化時(shí)間為15 min.
1.5.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化
采用單因素試驗(yàn)的方法分別考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度,活性干酵母添加量和蒸米時(shí)間對(duì)發(fā)酵完成后壓榨過濾的濾液中還原糖含量、總酸含量、酒精度的影響,然后采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化.
由圖1 可知,在液化和糖化過程中,隨著酶解時(shí)間的延長,水解液DE 值逐漸增大,之后趨于穩(wěn)定.在小米淀粉液化和糖化過程中,液化180 min和糖化25 h 內(nèi),酶解液DE 值增加較快,之后增加緩慢趨于穩(wěn)定.為了節(jié)約時(shí)間以提高效率,確定液化時(shí)間為180 min,此時(shí)液化DE 值為18.61%;糖化時(shí)間為25 h,此時(shí)糖化DE 值為43.01%.
圖1 液化時(shí)間對(duì)小米液化和糖化的影響
由圖2 可知,隨著α-淀粉酶和糖化酶添加量的增加,DE 值迅速升高;但當(dāng)α-淀粉酶添加量大于32 U/g,糖化酶添加量大于150 U/g 時(shí),DE 值基本趨于穩(wěn)定.這是由于加酶量較小時(shí),底物質(zhì)量濃度大于酶的質(zhì)量濃度,加酶量對(duì)反應(yīng)速率的影響較大,DE 值隨著加酶量的增加而快速增大;隨著加酶濃度逐漸增大,酶促反應(yīng)速率受底物濃度的制約,致使水解液DE 值基本不變.考慮到成本因素,32 U/g 為α-淀粉酶較優(yōu)的加酶量,150 U/g 為糖化酶較優(yōu)的加酶量.
圖2 酶添加量對(duì)小米液化和糖化的影響
由圖3 可知,水解液DE 值隨溫度升高先增大后減少,液化溫度為80 ℃時(shí)液化液DE 值最大,可達(dá)17.38%;糖化溫度為60 ℃時(shí)最終糖化液DE 值最高,可達(dá)45.6%.酶解溫度同時(shí)影響酶促反應(yīng)速率和酶的活性,當(dāng)溫度較低時(shí),隨酶解溫度的升高,酶促反應(yīng)速率加快;而當(dāng)溫度超過最適溫度時(shí),隨溫度的繼續(xù)升高,酶變性失活,酶促反應(yīng)速率迅速下降.因此,液化的較優(yōu)溫度在80 ℃左右,糖化的較優(yōu)溫度在60 ℃左右.
由圖4 可知,水解液DE 值隨著pH 值的增大而先升高后降低,液化和糖化階段最適pH 值都在6 左右,即蒸煮后小米在自然狀態(tài)下酶解液DE 值最大,液化時(shí)DE 值達(dá)到16.81%,糖化時(shí)DE 值達(dá)到39.6%.pH 值會(huì)影響極性基團(tuán)和酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性,從而影響酶分子中活性基團(tuán)的構(gòu)象以及與底物的結(jié)合力和催化能力.α-淀粉酶和糖化酶在最適作用pH 值范圍內(nèi)才能很好地發(fā)揮作用.水解液過堿或過酸都會(huì)影響其穩(wěn)定性,導(dǎo)致酶活性降低,影響酶解速率.
圖3 溫度對(duì)小米液化和糖化的影響
圖4 pH 對(duì)小米液化和糖化的影響
2.2.1 發(fā)酵過程單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析
由圖5 可知,隨蒸米時(shí)間的增加,發(fā)酵結(jié)束后濾液的酸度、酒精度和還原糖含量都呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢.蒸米時(shí)間過短,則造成液化糖化后還原糖含量低,影響后續(xù)酵母的繁殖,蒸米時(shí)間過長則造成能源資源的浪費(fèi),因此確定小米的蒸煮時(shí)間為40 min.
圖5 蒸米時(shí)間對(duì)酒質(zhì)的影響
由圖6 可知,發(fā)酵溫度過高,發(fā)酵結(jié)束時(shí),其濾液的總酸含量較高,當(dāng)發(fā)酵溫度為32 ℃,濾液的總酸含量為0.6 g/100 mL.發(fā)酵溫度較低時(shí),酵母新陳代謝減慢,增殖緩慢,酵母消耗還原糖和產(chǎn)酒精量較少.因此,確定發(fā)酵溫度為28 ℃.
圖6 發(fā)酵溫度對(duì)酒質(zhì)的影響
由圖7 可知,隨發(fā)酵時(shí)間的延長,在4 d 內(nèi)濾液中的總酸含量和酒精度都增加較快,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5 d 時(shí),酒精度含量有所降低,總酸含量增加.從黃酒酒質(zhì)要求酒精度較高、酸度和還原糖含量適宜的角度,確定黃酒發(fā)酵時(shí)間為4 d.
圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒質(zhì)的影響
由圖8 可知,酵母添加量較少時(shí),發(fā)酵緩慢,濾液中酒精度較低,隨酵母添加量的增加,濾液中酒精含量逐漸增高,從圖8 可知,當(dāng)酵母添加量超過0.2‰,由于酵母添加量較多,其繁殖消耗的還原糖含量增加,造成還原糖轉(zhuǎn)化為酒精含量減少,所以酒精度有所降低.因此,確定活性干酵母的添加量為0.2‰.
2.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化(表1、表2)
試驗(yàn)表明:影響黃酒發(fā)酵質(zhì)量的主要因素是發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間.各因素對(duì)還原糖含量影響的主次順序?yàn)椋篈>B>D>C;各因素對(duì)總酸含量影響的主次順序?yàn)椋築>A>D>C;各因素對(duì)酒精度影響的主次順序?yàn)锳>D>B>C.溫度對(duì)還原糖含量、總酸含量和酒精度的影響均顯著,發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸度含量的影響顯著.因此,從還原糖含量、總酸含量、酒精度及節(jié)能方面考慮,確定小米黃酒的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵時(shí)間4 d,發(fā)酵溫度28 ℃,酵母添加量0.2‰,最佳蒸米時(shí)間40 min.
圖8 酵母添加量對(duì)酒質(zhì)的影響
在傳統(tǒng)工藝制曲拌曲過程中,若制曲不當(dāng),生曲、燒曲的現(xiàn)象可能導(dǎo)致黃酒發(fā)酵“酸敗”,拌曲時(shí)不只有糖化菌的存在還可引入其他腐敗類產(chǎn)酸菌,影響酒質(zhì)和口感[10-11].試驗(yàn)中用α-淀粉酶液化淀粉、糖化酶糖化淀粉明顯減少了雜菌的生長,同時(shí)也消除了雜菌帶給黃酒批次間的不穩(wěn)定因素.控制合適的蒸米時(shí)間,是發(fā)酵原料處理的關(guān)鍵,若蒸米時(shí)間過短,有硬心現(xiàn)象的出現(xiàn),則造成后續(xù)液化糖化階段酶解困難,從而影響后續(xù)的酵母發(fā)酵.在小米液化過程中選擇合適的溫度和酶添加量對(duì)還原糖總量的影響較為重要,糖化過程中除了選擇合適的溫度外還應(yīng)注意選擇合適的糖化時(shí)間,以滿足后續(xù)酵母的發(fā)酵所需的總還原糖含量.因此,確定蒸米時(shí)間為40 min,小米的液化時(shí)間為180 min,液化溫度為80 ℃,液化pH 為6.0,α-淀粉酶添加量為32 U/g;糖化時(shí)間為25 h,糖化溫度為60 ℃,糖化pH 為6.0,糖化酶添加量為150 U/g.在酵母發(fā)酵過程中,發(fā)酵溫度和時(shí)間是形成酒質(zhì)口感的關(guān)鍵因素,溫度過高黃酒酸敗的可能性增加,發(fā)酵時(shí)間過長也將導(dǎo)致總酸含量的增加、酒精度的降低.因此,確定最佳發(fā)酵時(shí)間為4 d,發(fā)酵溫度為28 ℃.
表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
表2 正交試驗(yàn)方差分析
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