康保國，陳 宏，楊 茜，曹學(xué)武，紀 華

(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院腫瘤科，昆明 650032)

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著環(huán)境污染的不斷加重，肺癌患者的數(shù)量逐年增加[1-2]。然而，常規(guī)的手術(shù)、放療、化療和生物治療雖然在一定程度上延長了患者的生存期，但大部分患者最終由于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗，因此研究更加有效的肺癌治療方法，對于延長患者生存期、提高患者的生存質(zhì)量具有重要意義。本研究利用前期研究構(gòu)建的同步放大基因電路系統(tǒng)提高目的基因胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因的表達，通過放療聯(lián)合TK/丙氧鳥苷(ganciclovir，GCV)自殺基因系統(tǒng)共同作用，促進肺腺癌細胞凋亡，以探尋肺癌治療的新途徑。

1 材料與方法

1.1材料 抗性篩選試劑G418為美國MBI公司產(chǎn)品，lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，含10%胎牛血清的達爾伯克必需基本培養(yǎng)液為美國Gibco公司產(chǎn)品，凋亡檢測試劑盒轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(TUNEL)法購自瑞士Roche公司，人肺腺癌細胞株(A549細胞)為本科室儲備。放射源：X射線(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院腫瘤放療中心)。

1.2方法 將前期研究中構(gòu)建的pfos-iNOS/TK治療載體轉(zhuǎn)染A549細胞。G418篩選陽性克隆。分別取轉(zhuǎn)染治療載體的細胞(轉(zhuǎn)染治療載體組)和未轉(zhuǎn)染的對照細胞(未轉(zhuǎn)染組)通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase/polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測細胞中TK基因的表達。將陽性轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染的A549細胞按0.6×104/孔。分別接種于4個96孔板,每板接種20孔，轉(zhuǎn)染治療載體組和未轉(zhuǎn)染組各2個(并于1個未接種的孔內(nèi)加入同種培養(yǎng)液作為空白孔)。其中，1個96孔板中轉(zhuǎn)染pfos-iNOS/TK的A549細胞每孔中加入10 μmol/L GCV，1個未轉(zhuǎn)染的A549細胞每孔中加入1000 μmol/L GCV；另外2個板給予2 Gy X射線照射，8 h后于受照射的培養(yǎng)板中每孔加入10 μmol/L GCV。于照射后36 h，輕輕吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，枸櫞酸鹽緩沖液漂洗；干燥后，用4%多聚甲醛溶液固定，室溫放置1 h。按照TUNEL法檢測各組細胞的凋亡率[3]。光鏡下觀察細胞凋亡百分率,至少觀察5個視野,計數(shù)200個細胞，計數(shù)各組表達陽性細胞百分比。

2 結(jié) 果

2.1治療載體在轉(zhuǎn)染細胞基因組內(nèi)整合檢測 取轉(zhuǎn)染治療載體及未轉(zhuǎn)染A549細胞提取RNA，經(jīng)RT-PCR反應(yīng)、電泳、凝膠成像結(jié)果見圖1。在轉(zhuǎn)染細胞中RT-PCR檢測到轉(zhuǎn)染的TK基因片段，而未轉(zhuǎn)染的A549細胞中只能檢測到內(nèi)參，未檢測到TK基因。

a.未轉(zhuǎn)染細胞 b.轉(zhuǎn)染細胞 c.空白對照圖1 RT-PCR檢測目的基因TK在轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞中的表達

2.2GCV對轉(zhuǎn)染治療載體組和未轉(zhuǎn)染組細胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染治療載體組的細胞給予10 μmol/L GCV即可檢測到細胞凋亡，但凋亡率較低，為(16.8±0.52)%(圖2，見封三)；未轉(zhuǎn)染的A549細胞給予1000 μmol/L GCV僅可觀測到極少的細胞發(fā)生凋亡，為(6.2±0.61)%(圖3，見封三)。轉(zhuǎn)染治療載體組與未轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.086，P=0.025)。

2.3放療聯(lián)合GCV對轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞凋亡活性的影響 兩種細胞都給予2 Gy X射線照射聯(lián)合GCV作用后，轉(zhuǎn)染治療載體組大量細胞發(fā)生凋亡，凋亡率為(86.58±0.83)%(圖4，見封三)，而未轉(zhuǎn)染組僅有少量細胞發(fā)生凋亡，凋亡率為(28.3±0.69)%(圖5，見封三)，轉(zhuǎn)染治療載體組與未轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.012，P=0.005)。

3 討 論

由于環(huán)境污染的不斷加重及肺癌診斷水平的提高，近年來肺癌的發(fā)病率不斷增加[4]。雖然生物靶向治療藥物的出現(xiàn)給肺癌患者提供了新的治療選擇，但并沒有從根本上有效降低肺癌的病死率。TK/GCV自殺基因系統(tǒng)通過將前藥酶基因?qū)爰毎竽軌蚓幋a相應(yīng)的酶，后者可將一些無毒或低毒的物質(zhì)(GCV)代謝成具有毒性的物質(zhì)，從而導(dǎo)致瘤細胞死亡[5-6]。然而，單純TK/GCV自殺基因系統(tǒng)的臨床療效通常不十分理想,主要原因之一是經(jīng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細胞，TK表達水平低且僅限于部分腫瘤細胞；另外，有效劑量的GCV[100 mg(kg·d)]對機體可能產(chǎn)生嚴重的毒性效應(yīng),主要并發(fā)癥有腎功能受損(40%～60%)和骨髓抑制(20%～41%)等[7],限制了TK基因治療的療效和應(yīng)用范圍。前期研究證實,通過放射誘導(dǎo)的同步放大基因電路系統(tǒng)可以調(diào)控目的基因TK高效、特異性表達，從而解決了基因表達效率低、特異性差的問題[1]。

本研究中，轉(zhuǎn)染治療載體細胞內(nèi)通過RT-PCR檢測到TK基因的表達，而未轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)無TK基因表達，說明TK基因與被轉(zhuǎn)染細胞基因成功整合。轉(zhuǎn)染治療載體組的細胞給予10 μmol/L GCV即可檢測到細胞凋亡，但凋亡率較低，再一次證實了單純TK/GCV自殺基因系統(tǒng)誘導(dǎo)細胞凋亡的效率低[8]。給予2 Gy X射線照射聯(lián)合GCV作用后，轉(zhuǎn)染治療載體組大量細胞發(fā)生凋亡，究其原因:一方面，X射線激活放射誘導(dǎo)的同步放大基因電路，顯著提高了TK/GCV自殺基因系統(tǒng)的殺傷效率，另一方面，高濃度的一氧化氮既有直接的瘤細胞殺傷作用，又可以提高瘤細胞的放療敏感性[9-10]。這樣，由X射線、GCV、一氧化氮三者共同作用，進一步提高了肺癌細胞的凋亡比率。

有關(guān)基因治療的試驗研究層出不窮，預(yù)期效果也令人滿意，但真正應(yīng)用到臨床治療當中帶來的治療獲益比并不高[11]。這可能與基因治療技術(shù)中存在的基因靶向轉(zhuǎn)移困難、基因表達水平低且短暫、轉(zhuǎn)移后基因表達缺乏有效的調(diào)控手段以及腫瘤病因復(fù)雜而缺乏有效目的基因等因素有關(guān)[12]。因此，研究開發(fā)轉(zhuǎn)染效率更強、特異性更高的載體和調(diào)控更加精細、準確的轉(zhuǎn)錄序列將使更多的肺癌患者受益于腫瘤基因治療。

[1] 康保國，王衛(wèi)東，陳正堂，等.放射誘導(dǎo)HSV-TK基因在肺癌細胞中靶向、高效性表達的研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2007，36(6)：505-507.

[2] 孫霞,魏嘉,劉寶瑞.EML4-ALK陽性表達非小細胞肺癌患者的臨床特征及治療現(xiàn)狀[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2013,18(1)：78-81.

[3] 趙珊，馬迎春，劉亞坤.姜黃素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和JNK通路過度活化減輕小鼠肺缺血再灌注損傷[J].中國病理生理雜志，2013,29(2)：308-313.

[4] 劉明強，洪志鵬.肺腫瘤手術(shù)治療的現(xiàn)狀與未來[J/CD].中華肺部疾病雜志:電子版,2013，6(1)：53-55.

[5] Kri?tafor S,Novakovi I,Gazivoda Kraljevi T,etal.A new N-methyl thymine derivative comprising a dihydroxyisobutenyl unit as ligand for thymidine kinase of herpes simplex virus type 1(HSV-1 TK)[J].Bioorg Med Chem Lett,2011,21(20):6161-6165.

[6] Wang Y,Canine BF,Hatefi A.HSV-TK/GCV cancer suicide gene therapy by a designed recombinant multifunctional vector[J].Nanomedicine,2011,7(2):193-200.

[7] 李洋，馬程遠，里程楠,等.自殺基因系統(tǒng)HSV-TK/GCV聯(lián)合聲動力療法對人肺癌細胞NCI-446的體外殺傷實驗[J].腫瘤防治研究，2013，40(30)：226-231.

[8] Paíno T,Gangoso E,Medina JM,etal.Inhibition of ATP-sensitive potassium channels increases HSV-tk/GCV bystander effect in U373 human glioma cells by enhancing gap junctional intercellular communication[J].Neuropharmacology,2010,59(6):480-491.

[9] Reynolds MM,Witzeling SD,Damodaran VB,etal.Applications for nitric oxide in halting proliferation of tumor cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,431(4):647-651.

[10] Hong H,Sun J,Cai W.Multimodality imaging of nitricoxide and nitricoxide synthases[J].Free Radic Biol Med,2009,47(6):684-698.

[11] Zhang J,Tian H,Li C,etal.Antitumor effects obtained by autologous Lewis lung cancer cell vaccine engineered to secrete mouse interleukin 27 by means of cationic liposome[J].Mol Immunol,2013,55(3/4):264-274.

[12] Asadi-Moghaddam K,Chiocca EA.Gene-and viral-based therapies for brain tumors[J].Neurotherapeutics,2009,6(3):547-557.