趙棟，鄭琛，2＊，李發(fā)弟，2，李沖，2，李廷福

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 民勤733300；3.民勤中天羊業(yè)有限公司，甘肅 民勤733300）

葡萄渣主要是葡萄皮、葡萄籽和葡萄梗等，是葡萄加工或葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生的下腳料［1－2］。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，可作為非常規(guī)飼料開發(fā)利用。我國(guó)是葡萄生產(chǎn)的大國(guó)之一，2009年全國(guó)產(chǎn)葡萄794.1萬(wàn)t，其中約40%用于釀酒，葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中約產(chǎn)生60萬(wàn)t葡萄渣。葡萄渣集中于生產(chǎn)過(guò)程，易于收集和貯存，在飼料上的利用優(yōu)勢(shì)明顯。近年來(lái)有較多葡萄渣綜合利用的研究報(bào)道，但主要集中于其有效成分提取工藝和生物活性的研究，作為一種非常規(guī)飼料報(bào)道較少。

對(duì)瘤胃微生物生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)控能夠增加瘤胃發(fā)酵的效率，并最終提高動(dòng)物生產(chǎn)性能是動(dòng)物生產(chǎn)的主要目標(biāo)。含有精油、單寧、皂苷、黃酮和許多其他植物次生代謝物的植物或植物提取物被證實(shí)能改善瘤胃代謝，如降低甲烷產(chǎn)量和瘤胃蛋白質(zhì)的降解、增加微生物蛋白質(zhì)的合成和瘤胃微生物蛋白流向十二指腸［3］。葡萄渣含有豐富的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、無(wú)氮浸出物和礦物質(zhì)［4］，其縮合單寧含量為21～36g/kg DM［5］。單寧是植物中存在一類復(fù)雜的多酚類次生代謝物，包括縮合單寧（condensed tannin，CT）與水解單寧（hydrolysable tannin，HT）。單寧的化學(xué)性質(zhì)活潑，易與蛋白質(zhì)結(jié)合，因此一直被認(rèn)為是飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。然而，研究發(fā)現(xiàn)反芻動(dòng)物采食縮合單寧含量較高的飼草后，由于過(guò)瘤胃蛋白數(shù)量增加而提高蛋白質(zhì)的利用效率［6］。目前人們僅認(rèn)識(shí)到單寧對(duì)飼料蛋白質(zhì)具有保護(hù)作用，但對(duì)綿羊的具體應(yīng)用方法和劑量仍不明確。本研究選用已知縮合單寧含量的葡萄渣，通過(guò)消化代謝試驗(yàn)測(cè)定飼糧中不同含量葡萄渣單寧對(duì)綿羊養(yǎng)分消化代謝及瘤胃發(fā)酵的影響，旨在為提高飼糧中蛋白質(zhì)的利用效率、合理有效地利用現(xiàn)有飼料資源和葡萄渣的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

于2012年12月－2013年4月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物訓(xùn)練中心及動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

選用石羊河葡萄酒廠的鮮葡萄渣，自然干燥后用植物粉碎機(jī)粉碎，過(guò)1.0mm篩后用自封袋封裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用4×4拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每期試驗(yàn)17d，其中預(yù)試期10d，正試期7d。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)飼糧處理，處理1為不含葡萄渣的基礎(chǔ)飼糧，處理2至處理4分別為含5%，10%和15%葡萄渣的飼糧，各處理的縮合單寧含量分別為0.00，0.85，1.70和2.25g/kg DM。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選取4只身體健康且安裝永久瘤胃瘺管羯羊［薩?？耍⊿uffolk）♂×小尾寒羊（small tail Hanyang）♀］，年齡約2.5歲，體重28kg左右。綿羊單籠飼養(yǎng)，每只綿羊每天飼喂1kg飼料。在過(guò)渡期每只綿羊均飼喂基礎(chǔ)飼糧，每日8：00和16：00兩次等量飼喂，準(zhǔn)確記錄每只綿羊采食量。綿羊自由飲水。預(yù)試期及正試期按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)飼喂試驗(yàn)飼糧，飼喂方式和飼養(yǎng)管理制度不變。

1.5 試驗(yàn)飼糧配方

參照中國(guó)肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 816－2004）中體重30kg、日增重0.1kg/d的育成公綿羊營(yíng)養(yǎng)推薦量配制試驗(yàn)飼糧（表1）。

表1 試驗(yàn)飼糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Composition and nutritional levels of diets

1.6 樣品的采集及處理

每期試驗(yàn)的正試期采集飼糧、糞樣和尿樣。正試期最后1d在食前及食后2，4，6和8h從綿羊的瘺管中抽取50mL瘤胃液，立即測(cè)定瘤胃液的pH值，然后用4層紗布過(guò)濾，收集于采樣瓶中，并加入1mL飽和HgCl2溶液使酶滅活，放入－20℃冰箱冷凍保存。

飼料、糞、尿中干物質(zhì)，粗蛋白質(zhì)，中性洗滌纖維，酸性洗滌纖維，鈣和磷的測(cè)定采用常用方法［8］；瘤胃液pH用Sartorius PB－10型酸度計(jì)測(cè)定；瘤胃液氨氮采用馮宗慈和高民［9］改進(jìn)后的比色法測(cè)定；瘤胃液尿素氮采用二乙酰一肟法測(cè)定（試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程所）；飼料和糞樣中的能量采用XRY－1C真空彈微電腦自動(dòng)熱量計(jì)測(cè)定；瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）采用氣相色譜法（安捷倫6890N氣相色譜儀）測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行拉丁方方差分析，差異顯著時(shí)，采用Tukey法進(jìn)行多重比較，并用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊養(yǎng)分表觀消化率

處理4綿羊?qū)︼暭Z氮的消化率極顯著高于處理2綿羊（P＝0.007）且顯著高于處理1綿羊（P＝0.019），處理3綿羊?qū)︼暭Z氮的消化率顯著高于處理2綿羊（P＝0.046）；處理4綿羊?qū)︼暭Z氮的存留率顯著高于其他各組綿羊（P＝0.012，P＝0.016，P＝0.025）。其余差異不顯著（P＞0.05）（表2）。

2.2 綿羊瘤胃內(nèi)氮濃度

處理1綿羊瘤胃液中總氮濃度極顯著高于其他各處理綿羊（P＝0.003，P＜0.001，P＜0.001）；處理1綿羊瘤胃液中蛋白氮濃度極顯著高于處理3綿羊（P＝0.001）且顯著高于處理4綿羊（P＝0.017）；處理4綿羊瘤胃液中尿素氮濃度極顯著高于處理2和3綿羊（P＝0.003，P＜0.001）并顯著高于處理1綿羊（P＝0.030）。其余差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

表2 綿羊養(yǎng)分表觀消化率及氮存留率Table 2 The apparent digestibility of nutrients and nitrogen retention of sheep %

表3 綿羊瘤胃液中氮濃度Table 3 Nitrogen concentration in ruminal fluid of sheep mg/100mL

處理1，2和3綿羊瘤胃液中總氮濃度動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致（圖1a），采食后總氮濃度下降，食后4h降至最低值后逐漸升高，處理4綿羊瘤胃液中總氮濃度食后2h降至最低值后逐漸升高（圖1）；4個(gè)處理綿羊瘤胃液中氨氮濃度動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致（圖1b），食后2h氨氮濃度升至最高值后逐漸降低，在食后6h降至最低值然后升高；處理1，2和3綿羊瘤胃液中尿素氮濃度在食后下降（圖1c），處理1和3在食后4h降至最低值后升高，處理2在食后6h降至最低值后升高，處理4綿羊食后尿素氮濃度升高，在食后2h升至最高值后下降，食后4h降至最低值后升高；4個(gè)處理綿羊瘤胃液中蛋白氮濃度動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致（圖1d），處理1，3和4在食后2h降至最低值，處理2在食后4h降至最低值，然后升高。

2.3 綿羊瘤胃液pH及揮發(fā)性脂肪酸濃度

處理4綿羊瘤胃液中丙酸摩爾比極顯著高于處理1和2綿羊（P＜0.001，P＝0.003），處理3綿羊瘤胃液中丙酸摩爾比極顯著高于處理1綿羊（P＝0.009）；處理1綿羊瘤胃液中丁酸摩爾比和乙丙比極顯著或顯著高于處理4和處理3綿羊（P＝0.006，P＝0.034；P＝0.001，P＝0.031），處理2綿羊瘤胃液中乙丙比顯著高于處理4綿羊（P＝0.028）。其余差異不顯著（P＞0.05）（表4）。

食后各處理組綿羊瘤胃液中pH、總揮發(fā)性脂肪酸及乙酸、丙酸、丁酸摩爾比和乙丙比動(dòng)態(tài)變化基本一致（圖2）。食后各處理綿羊瘤胃液pH逐漸下降（圖2a）；食后各處理綿羊瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸升高（圖2b），在食后4 h升至最高值后下降；食后各處理綿羊瘤胃液乙酸摩爾比和乙丙比升高（圖2f），食后2h或食后4h升至最高值，然后下降；食后各處理組綿羊瘤胃液丙酸和丁酸摩爾比下降（圖2d，e），食后2h或食后4h降至最低值，然后升高。

圖1 綿羊瘤胃氮濃度參數(shù)動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of nitrogen concentration in ruminal fluid of sheep

表4 綿羊瘤胃液pH、總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）濃度及各種酸的摩爾比Table 4 The pH，total volatile fatty acids and molar ratio of each acid to total volatile acids in ruminal fluid of sheep

3 討論

3.1 綿羊養(yǎng)分表觀消化率

Barry和Forss（1983）［10］在試驗(yàn)中給綿羊飼喂長(zhǎng)柄百脈根（Lotuscorniculatus），發(fā)現(xiàn)隨著縮合單寧濃度的上升，有機(jī)物和纖維素的瘤胃降解率均呈下降趨勢(shì)。單寧對(duì)反芻動(dòng)物消化過(guò)程的影響很復(fù)雜。單寧結(jié)構(gòu)中的大量酚羥基團(tuán)和芳香環(huán)基團(tuán)與飼料以及動(dòng)物體內(nèi)的蛋白質(zhì)或酶的肽基、氨基以及羧基等以氫鍵的形式多位點(diǎn)結(jié)合，形成不易消化的復(fù)合物使腸道微生物對(duì)氮的有效利用率下降，導(dǎo)致飼料中養(yǎng)分的消化率下降。Khazaal和Orskov（1994）［11］在對(duì)各種不同縮合單寧含量牧草進(jìn)行體外試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)單寧濃度與體外干物質(zhì)降解率呈負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)中，葡萄渣單寧對(duì)飼糧干物質(zhì)、有機(jī)物、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、鈣和磷的表觀消化率均沒有產(chǎn)生顯著的影響，可能與單寧濃度及來(lái)源有關(guān)，因?yàn)椴煌瑏?lái)源單寧對(duì)養(yǎng)分降解率的影響存在顯著差異［8］，而且這也說(shuō)明本次試驗(yàn)中采用的縮合單寧濃度還不能對(duì)養(yǎng)分表觀消化率產(chǎn)生顯著影響。

圖2 綿羊瘤胃參數(shù)動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of parameters in ruminal fluid of sheep

本次試驗(yàn)中，處理4綿羊的氮表觀消化率顯著高于處理2和處理1綿羊，且氮存留率顯著高于其他各組綿羊，可能與提高綿羊過(guò)瘤胃蛋白及降低尿氮排出有關(guān)。單寧－蛋白質(zhì)復(fù)合物在瘤胃內(nèi)不易降解，會(huì)提高粗蛋白質(zhì)的過(guò)瘤胃率，雖然可能因此而降低瘤胃微生物合成效率，但飼糧粗蛋白質(zhì)利用率高時(shí)，可通過(guò)降低尿氮排出而提高機(jī)體氮存留率。Cortés等（2009）［12］的研究也發(fā)現(xiàn)，將從朱櫻花（Calliandrahaematocephala）、大葉千斤拔（Moghamiamacro－phylla）和銀合歡（Leucaenaglauca）中提純的縮合單寧按照0，300，600，900mg/g豆粕粗蛋白質(zhì)的比例添加到豆粕中后，干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的體外降解率極顯著降低且過(guò)瘤胃蛋白含量提高。張曉慶等（2010）［13］的研究也證實(shí)，紅豆草（Onobrychisviciaefolia）單寧可通過(guò)顯著降低綿羊尿氮排出而提高氮存留率。

3.2 綿羊瘤胃內(nèi)氮濃度

反芻動(dòng)物瘤胃液中的總氮包括氨氮、尿素氮、飼料中可溶解的蛋白氮以及菌體蛋白氮等，飼糧粗蛋白質(zhì)含量和降解率對(duì)瘤胃液總氮有直接影響［14］，其中，氨氮濃度是反映反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)氮降解的最重要指標(biāo)。氨氮是反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)肽、氨基酸、氨化物、尿素和其他非蛋白氮化合物分解的終產(chǎn)物，同時(shí)又是微生物合成菌體蛋白的原料，反映飼糧蛋白質(zhì)的含量、其瘤胃降解特性和微生物的合成狀況［15］。本試驗(yàn)中，各處理綿羊瘤胃氨氮濃度無(wú)差異的情況下，處理1綿羊瘤胃液總氮濃度極顯著高于其他各組綿羊，說(shuō)明單寧在抑制飼糧粗蛋白質(zhì)降解的同時(shí)對(duì)瘤胃微生物合成也存在負(fù)面影響，從而導(dǎo)致氨的積累。Wang等（2007）［16］曾報(bào)道，利用紅豆草干草飼喂綿羊時(shí)導(dǎo)致綿羊瘤胃氨氮濃度顯著降低，這可能與不同試驗(yàn)中單寧濃度與來(lái)源不同有關(guān)，本試驗(yàn)中該濃度的葡萄渣單寧對(duì)瘤胃微生物的影響更為明顯。本次試驗(yàn)中，各處理綿羊瘤胃總氮和氨氮濃度從食前至食后8h的變化規(guī)律基本一致，且符合反芻動(dòng)物瘤胃氮濃度變化的一般規(guī)律，因?yàn)橥豕痃龋?005）［17］認(rèn)為，采食為微生物提供了必需的營(yíng)養(yǎng)，較強(qiáng)的咀嚼和反芻作用使精料中的蛋白質(zhì)不斷的降解釋放，同時(shí)使粗料中的細(xì)胞可溶性物質(zhì)不斷的溢出，使氨氮濃度迅速增至峰值，隨著在瘤胃內(nèi)被微生物的利用和瘤胃壁的吸收，氨氮濃度逐漸下降，在下次采食后會(huì)出現(xiàn)回升現(xiàn)象。

瘤胃液尿素氮濃度受飼料內(nèi)尿素氮含量及其溶解速度、唾液分泌及經(jīng)瘤胃壁吸收入血液的氨態(tài)氮濃度的影響。本試驗(yàn)中，處理4綿羊瘤胃液中尿素氮濃度顯著高于其他處理綿羊，可能與單寧的澀味刺激唾液分泌并使較多再循環(huán)尿素進(jìn)入瘤胃有關(guān)［18］，但處理2和3綿羊瘤胃液尿素氮濃度卻沒有呈現(xiàn)出相同變化規(guī)律，是否與單寧含量存在相關(guān)，還需要做進(jìn)一步研究。

瘤胃液蛋白氮包括飼料蛋白氮中可溶解部分，微生物蛋白氮及唾液蛋白氮。瘤胃液蛋白氮可反映瘤胃中氨被瘤胃微生物利用的狀況［19］。而飼糧中的可降解蛋白是合成微生物蛋白的主要氮源。本試驗(yàn)中，單寧的添加顯著降低了綿羊瘤胃液蛋白氮濃度，與單寧抑制飼糧粗蛋白質(zhì)在瘤胃中降解的結(jié)果相符，此外，由于單寧對(duì)瘤胃微生物產(chǎn)生的不利影響，最終導(dǎo)致瘤胃液蛋白氮濃度顯著降低。

3.3 綿羊瘤胃液pH及揮發(fā)性脂肪酸

瘤胃液pH是反映反芻動(dòng)物瘤胃綜合發(fā)酵水平的重要指標(biāo)，它主要受到飼糧性質(zhì)、有機(jī)酸積聚和唾液分泌量等因素影響［20－21］。Murphy和 Kennelly（1987）［22］與韓正康和陳杰（1988）［23］指出，瘤胃內(nèi) pH 值變動(dòng)范圍為5.0～7.5，呈有規(guī)律形式變動(dòng)，取決于飼糧性質(zhì)和攝食后時(shí)間，一般于飼喂后2～6h達(dá)最低值。本試驗(yàn)各處理綿羊瘤胃液pH值隨時(shí)間的變化趨勢(shì)大致相同，也都處于正常變動(dòng)范圍。

飼料中的碳水化合物是動(dòng)物機(jī)體能量的主要來(lái)源，而在反芻動(dòng)物瘤胃中，有55%～95%的碳水化合物經(jīng)瘤胃微生物的降解，生成葡萄糖、果糖、木糖等己糖和戊糖，經(jīng)酵解轉(zhuǎn)化成丙酮酸后，進(jìn)一步分解成揮發(fā)性脂肪酸和ATP［24］。乙酸、丙酸和丁酸濃度的相對(duì)比例不僅受反芻動(dòng)物采食水平的影響，而且也受飼糧組成等因素的影響［25］。本試驗(yàn)中，單寧對(duì)綿羊瘤胃液總酸濃度和乙酸摩爾比沒有產(chǎn)生顯著的影響，但顯著提高丙酸摩爾比而顯著降低丁酸摩爾比和乙丙比，這可能與單寧抑制瘤胃微生物活性有關(guān)，因?yàn)榇诛暳辖到饴诰暳?，粗飼料降解抑制?huì)導(dǎo)致乙酸摩爾比降低更多，導(dǎo)致丙酸摩爾比相對(duì)升高而乙丙比相對(duì)降低。Ngsmdscng（2006）等［25］用體外法研究多種植物的發(fā)酵情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)縮合單寧含量對(duì)總揮發(fā)性脂肪酸與各種酸的產(chǎn)量均有顯著影響，縮合單寧含量高的植物其丙酸含量顯著增高，TVFA和乙酸顯著降低，也與本次試驗(yàn)結(jié)果相近。另外，綿羊瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸和各種酸摩爾比例隨采食時(shí)間推移的動(dòng)態(tài)變化，也符合瘤胃中養(yǎng)分降解及瘤胃微生物利用變化的規(guī)律［26］。

4 結(jié)論

葡萄渣單寧對(duì)綿羊干物質(zhì)、有機(jī)物、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、鈣和磷的表觀消化率沒有產(chǎn)生顯著影響，但顯著提高綿羊氮表觀消化率和存留率；顯著降低綿羊瘤胃液總氮和蛋白氮濃度而顯著提高尿素氮濃度，對(duì)綿羊瘤胃液氨氮濃度沒有產(chǎn)生顯著的影響；顯著提高綿羊瘤胃液丙酸摩爾比而顯著降低丁酸摩爾比和乙丙比，對(duì)綿羊瘤胃液pH、總揮發(fā)性脂肪酸濃度和乙酸及其他酸摩爾比沒有產(chǎn)生顯著的影響。

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