王碧霞，胥曉，李霄鋒

(1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充637009; 2.張家口市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量管理站，河北 張家口075000)

鉻在自然界中約占地殼總量的0.02%，常存在于土壤、大氣、水及各類生物體內(nèi)[1]。然而隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快，鉻被廣泛應(yīng)用于化工、冶金、機(jī)械等行業(yè)，它在環(huán)境中的排放速度顯著增加，逐漸成為土壤污染的5種主要重金屬之一[2]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年新排放鉻渣約60萬t，歷年累積存鉻渣近600萬t，受鉻嚴(yán)重污染的土壤已達(dá)1250多萬t[3]。一般而言，自然土壤中適量濃度的鉻對(duì)種子萌發(fā)和植物生長(zhǎng)是有利的[4-5]，但含量過高卻會(huì)導(dǎo)致植物葉綠素分解，光合作用下降[4-6]，細(xì)胞內(nèi)活性氧累積，產(chǎn)生氧化脅迫[7]，對(duì)植物生長(zhǎng)具有抑制作用。因此，研究不同鉻濃度下植物的光合生理特性變化，對(duì)了解植物對(duì)不同程度鉻污染土壤的適應(yīng)以及修復(fù)植物的篩選具有實(shí)際意義。目前，有關(guān)土壤鉻污染修復(fù)植物的研究?jī)H集中在少數(shù)幾種超富集植物上，如李氏禾(Leersiahexandra)、Dicomaniccolifera和Suterafodina[8-9]，但這類植物通常生長(zhǎng)慢、植株小、周期長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)效益低，導(dǎo)致其在植物修復(fù)工程中應(yīng)用較少。因此，選用生長(zhǎng)快、周期短、具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的普通植物用于重金屬鉻污染土壤的修復(fù)具有重要意義。

葎草(Humulusscandens)為?？?Moraceae)葎草屬(Humulus)，一年生或多年生草本，在我國(guó)青海、新疆、甘肅、西藏等省、市廣泛分布，其嫩莖和葉可用于畜禽飼料和添加劑，還可全草入藥，具有醫(yī)療、保健等功效。葎草生性強(qiáng)健、抗逆性強(qiáng)，不僅是工程礦地、裸露地和棄耕地的先鋒物種，而且在控制水土流失、改善生態(tài)環(huán)境方面也具有明顯優(yōu)勢(shì)。鑒于葎草在中藥材方面的大量運(yùn)用，近年來多數(shù)研究主要集中在其化學(xué)成分、藥用成分，遺傳育種等生理生化方面[10-12]，同時(shí)也偶見葎草在水分、增溫脅迫下具有性別差異的文獻(xiàn)[13-14]，但重金屬脅迫對(duì)葎草生理生態(tài)的影響尚未見報(bào)道。故本研究以常見的葎草為試材，研究不同鉻濃度對(duì)葎草幼苗葉片的氣體交換、丙二醛(MDA)含量、葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等生理生態(tài)指標(biāo)的影響，以期揭示鉻脅迫環(huán)境下葎草的抗逆性及該類植物對(duì)脅迫環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制，為葎草進(jìn)一步用于重金屬鉻污染土壤的修復(fù)植物研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

2012年10月中下旬采集南充市本地葎草野生種子，于2013年2月15日播種，待生長(zhǎng)1個(gè)月后，選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的50株幼苗移栽到體積為10 L的塑料盆內(nèi)，每盆裝入均質(zhì)土壤7.5 kg，河沙1.5 kg，每盆1株，緩苗20 d。于4月8日進(jìn)行鉻脅迫實(shí)驗(yàn)，重金屬試劑為Cr3+。參照王愛云等[5]的方法，設(shè)Cr3+濃度為0，50，200，300，500 mmol/L共5個(gè)處理，將Cr3+按相應(yīng)濃度配成1000 mL的溶液緩慢均勻澆灌于土壤中，每處理分別10株，對(duì)照組(10株)澆施等量清水。為防止溶液滲漏，對(duì)照組和處理組塑料盆內(nèi)均套有塑料袋(土壤置于塑料袋內(nèi))。

1.2 測(cè)量方法

1.2.1氣體交換參數(shù)測(cè)定 于2013年4月28日，隨機(jī)選取不同處理下的植株各5株，采用LI-6400便攜式光合測(cè)定儀(Li-Cor公司，美國(guó))測(cè)定氣體交換特征。每個(gè)處理隨機(jī)選擇5株，測(cè)定植株上部第5或6片全展向陽葉片。測(cè)定時(shí)間為上午8:00-11:30，測(cè)定指標(biāo)為凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)等。瞬時(shí)水分利用效率(WUEi)為Pn與Tr之比，氣孔限制值(Ls)[Ls=(Ca-Ci)/Ca]采用Berry和Downton[15]的方法計(jì)算。測(cè)定時(shí)的環(huán)境溫度為(28.0±1.0)℃；大氣相對(duì)濕度為40%～43%；大氣CO2濃度為(370±10) mmol/mol；光照強(qiáng)度為(1400±50) mmol/(m2·s)。

1.2.2丙二醛(MDA)含量及葉綠體色素含量測(cè)定 MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[16]，葉綠素含量的測(cè)定采用丙酮提取法[17]。

1.2.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定 采用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(Junior-Pam，Heinz Walz，Effeltrich, Germany)，測(cè)量前使功能成熟葉片經(jīng)過充分的暗適應(yīng)后，測(cè)定葎草成熟葉片的光下最大熒光(Fm′)、 光下最小熒光(Fo′)、初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、表觀光合電子傳遞速率(ETR)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)，均由儀器自動(dòng)測(cè)得，依次計(jì)算出PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)，可變熒光(Fv)(Fv=Fm-Fo)。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。平均值間的比較采用單因素方差分析方法(One-Way ANOVA)；不同處理間的差異用Duncan多重比較檢驗(yàn)(Duncan’s Multiple Range Test)。顯著性水平設(shè)定為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr3+脅迫下葎草幼苗氣體交換參數(shù)的變化

由圖1可以看出，Cr3+為50 mmol/L時(shí)，Pn和WUEi比對(duì)照顯著增高(圖1A和F)，Gs、Ci、Tr、Ls與對(duì)照無顯著差異；而200 mmol/L時(shí)，Pn則下降至與對(duì)照相近，Gs、Ci和Tr也大幅度下降，但Ls和WUEi相反，比對(duì)照顯著增加；同時(shí)，300 mmol/L時(shí)，與對(duì)照相比，Pn、Gs、Ci、Tr下降幅度更加顯著，Ls和WUEi仍然上升；然而，500 mmol/L時(shí)，Ci、Ls和WUEi卻突然下降(圖1B、E和F)，接近對(duì)照，但Pn、Gs、Tr仍大幅度降低(圖1A、C和D)。由此可見，葎草幼苗葉片的Pn、Gs、Ci、Tr、Ls、WUEi受到了Cr3+脅迫的顯著影響(P=0.000，P=0.000，P=0.003，P=0.000，P=0.000，P=0.000)，Pn、Gs、Ci、Tr隨著Cr3+脅迫的加重而降低，呈下降趨勢(shì)，Ls和WUEi呈上升趨勢(shì)。

2.2 Cr3+脅迫下葎草幼苗葉綠體色素含量的變化

由表1可以看出，Chl a和Chl b含量隨Cr3+脅迫的增加而逐漸降低，具有顯著差異(P=0.013，P=0.011)，其中，Cr3+為50 mmol/L時(shí)，二者分別比對(duì)照下降16.55%和15.09%，500 mmol/L時(shí)二者又減少40.00%和33.96%。同時(shí)，Chl a+b和Chl x含量也隨Cr3+脅迫的加重而降低，差異顯著(P=0.009，P=0.002)；當(dāng)Cr3+為50 mmol/L時(shí)，二者分別比對(duì)照下降16.67%和15.09%，500 mmol/L時(shí)二者下降幅度較大，分別為37.88%和43.43%。因此，Cr3+脅迫對(duì)葎草幼苗葉片的葉綠體色素含量具有較大影響，Chl a、Chl b、Chl a+b、Chl x含量隨Cr3+脅迫的加劇而逐漸降低，呈下降趨勢(shì)，尤其是Cr3+為500 mmol/L時(shí)葉綠體色素含量顯著下降。

圖1 鉻脅迫下葎草幼苗葉片的氣體交換特征

表1 鉻脅迫對(duì)葎草幼苗葉片葉綠體色素和丙二醛(MDA)含量的影響

注：測(cè)定值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Note: Each value is the mean±standard error, different letters in the same column mean significant difference atP<0.05, the same below.

2.3 Cr3+脅迫下葎草幼苗丙二醛(MDA)含量的變化

從表1可以看出，Cr3+為50 mmol/L時(shí)，MDA含量比對(duì)照下降7.49%，而200和300 mmol/L時(shí)MDA含量顯著上升，比對(duì)照高14.97%和15.51%，500 mmol/L時(shí)卻降低，雖比對(duì)照略高，但差異不顯著。從總體上來看，在不同Cr3+脅迫下，葎草幼苗葉片MDA含量存在差異(P=0.020)，隨Cr3+濃度的加劇呈上升的變化趨勢(shì)。

2.4 Cr3+脅迫下葎草幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

從表2可以看出，在不同Cr3+脅迫下，葎草幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)存在顯著差異。50 mmol/L時(shí)，F(xiàn)o′、Fm′、Fo、Fm和Fv均比對(duì)照顯著降低，在200和300 mmol/L脅迫時(shí)其變化不顯著，但仍然大幅度下降，且出現(xiàn)最小值，而500 mmol/L時(shí)，F(xiàn)o′、Fm′、Fo、Fm和Fv雖比對(duì)照仍顯著降低，但均有所增高。另外，ETR截然相反，50 mmol/L時(shí)最低(3.10 μmol/m2·s)，隨著Cr3+脅迫的加重，ETR逐漸升高，而在300 mmol/L濃度時(shí)出現(xiàn)最大值(27.35 μmol/m2·s)。從總體上來看，Cr3+脅迫導(dǎo)致葎草幼苗的Fo′、Fm′、Fo、Fm、Fv和ETR具有顯著影響(P=0.000，P=0.000，P=0.013，P=0.011，P=0.000，P=0.009)，Cr3+濃度越高，葎草葉片的Fo′、Fm′、Fo、Fm、Fv逐漸降低，呈下降趨勢(shì)，ETR卻逐漸增高，呈上升趨勢(shì)。

表2 鉻脅迫對(duì)葎草幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.5 Cr3+脅迫下葎草幼苗光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的變化

從圖2可以看出，Cr3+為50 mmol/L時(shí)，F(xiàn)v/Fo、Fv/Fm、qP、qN均比對(duì)照增高，但Fv/Fo、Fv/Fm增幅不顯著，而200 mmol/L時(shí)，四者卻均比對(duì)照降低，其中Fv/Fo和Fv/Fm下降顯著(圖2C和D)，且300 mmol/L時(shí)，F(xiàn)v/Fo和Fv/Fm仍然大幅度減少，qP也顯著降低，但qN增幅明顯(圖2A和B)；然而500 mmol/L時(shí)卻與之相反，F(xiàn)v/Fo、Fv/Fm、qP、qN均與對(duì)照相近，沒有顯著差異，其中Fv/Fo、Fv/Fm、qP突然升高，而qN則又下降。由此可以看出，Cr3+脅迫對(duì)葎草幼苗葉片光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心具有較大影響，其Fv/Fo、Fv/Fm、qP、qN差異顯著(P=0.002，P=0.003，P=0.003，P=0.006)，F(xiàn)v/Fo、Fv/Fm、qP隨Cr3+脅迫的加劇呈下降趨勢(shì)，qN變化無規(guī)律，但重度脅迫(500 mmol/L)時(shí)，F(xiàn)v/Fo、Fv/Fm、qP、qN均與對(duì)照接近。

圖2 鉻脅迫下葎草幼苗葉片的光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心特征

3 討論

3.1 低濃度Cr3+脅迫對(duì)葎草幼苗光合生理特性的影響

植物葉片凈光合速率(Pn)的大小是衡量植物光合作用能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，葎草幼苗在低濃度(50 mmol/L)Cr3+下Pn和WUEi顯著增高，而Gs、Ci、Tr和Ls均沒有變化。Ci和Gs是反映氣孔開張程度的重要指標(biāo)，其值的變化反映了葉肉細(xì)胞內(nèi)外CO2濃度的變化狀況。在本研究中，低濃度Cr3+(50 mmol/L)處理下葎草幼苗的光合速率顯著增加，而Gs和Ci均無顯著變化。因此，我們推測(cè)低濃度Cr3+脅迫下葎草凈光合速率的增高與氣孔行為無關(guān)，而極可能與光合色素、光系統(tǒng)中的電子傳遞能力和酶的活性增強(qiáng)有關(guān)。進(jìn)而，我們對(duì)葉片色素含量以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度Cr3+脅迫下葎草葉綠素a、b以及總色素含量均無顯著變化，而qP和qN均比對(duì)照顯著增加。根據(jù)陳建明等[18]的解釋，光化學(xué)淬滅系數(shù)qP反映了PSⅡ原初電子受體QA的還原狀態(tài)，qP愈大，PSⅡ的電子傳遞活性愈大；而qN反映的是P天線色素吸收的不能用于光合電子傳遞而以熱形式耗散掉的光能部分，是反映光合機(jī)構(gòu)自我保護(hù)機(jī)制的指標(biāo)。由此證實(shí)了低濃度Cr3+脅迫可能通過促進(jìn)了PSⅡ電子傳遞活性來增加了凈光合速率。因此，我們的研究結(jié)果表明了低濃度的Cr3+對(duì)植物的生長(zhǎng)具有一定的刺激作用。該結(jié)論與許建光等[19]認(rèn)為微量鉻能提高植物體內(nèi)某些酶的活性而促進(jìn)植物生長(zhǎng)的觀點(diǎn)完全一致。

3.2 中濃度Cr3+脅迫對(duì)葎草幼苗光合生理特性的影響

在中濃度(200～300 mmol/L)Cr3+脅迫下，我們發(fā)現(xiàn)隨著Cr3+脅迫的加重，Pn、Gs、Ci和Tr均下降，Ls上升。根據(jù)Farquhar和Sharkey[20]的觀點(diǎn)：當(dāng)Pn下降，Ci也減小，而Ls增大，可以認(rèn)為Pn的下降主要是由于Gs的降低；如果Pn下降，Ci升高，而Ls減少，便可以肯定葉肉細(xì)胞光合活性的降低是Pn下降的決定因素。因此，我們可以確定在中度Cr3+脅迫下Pn顯著下降的原因可能與氣孔限制所引起CO2進(jìn)入葉片受阻有關(guān)。然而，Ls與WUEi變化趨勢(shì)卻相似，隨著Cr3+濃度的增加而增加，其原因可能是氣孔減少對(duì)H2O分子的影響比CO2更大，受到脅迫時(shí)氣孔部分關(guān)閉，導(dǎo)致水分利用效率提高。此外，光合色素以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定結(jié)果表明，在中濃度(200～300 mmol/L)Cr3+脅迫下，與對(duì)照相比葎草葉片的葉綠素a、葉綠素b、總色素含量、類胡蘿卜素含量以及光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性(Fv/Fo)、最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)均顯著下降。Fv/Fm是開放的PSⅡ反應(yīng)中心捕獲激發(fā)能的效率，是反映植物PSⅡ受傷害程度的重要參數(shù)[21]。在中濃度Cr3+脅迫下，F(xiàn)m、Fv、Fv/Fo下降反映了葎草幼苗的PSⅡ反應(yīng)中心開放程度減弱，光合電子傳遞速度減慢，不僅碳同化速率降低，而且Rubisco和PSI與PSⅡ間的電子傳遞位點(diǎn)還可能遭到破壞[22]。

此外，Pandey和Sharma認(rèn)為[23]，Cr3+在植物體內(nèi)沒有一定的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，而是通過和鐵競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白才能到達(dá)植株上部，這樣葉片中的鐵含量會(huì)減少，造成葉綠素合成量減少[19]。所以，我們的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了中濃度的Cr3+脅迫可以對(duì)葉綠素合成產(chǎn)生嚴(yán)重影響，使得葉綠素含量顯著降低，導(dǎo)致光化學(xué)反應(yīng)過程中PSⅡ的酶和電子傳遞也受到顯著影響。

3.3 高濃度Cr3+脅迫對(duì)葎草幼苗光合生理特性的影響

在高濃度(500 mmol/L)Cr3+脅迫下，我們發(fā)現(xiàn)葎草植株的Pn、Gs、Tr與對(duì)照相比顯著降低，尤其是光合色素Chl a、Chl b、Chl a+b和Chl x的含量隨濃度越高其值顯著降到最低，而氣孔限制值(Ls)與胞間CO2濃度(Ci)卻無顯著變化。由此反映出隨Cr3+濃度的加重，Cr3+與鐵競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的現(xiàn)象加劇[23]，葉綠素合成量不僅受到影響，甚至影響其光合功能，從而導(dǎo)致了Pn的顯著下降。葎草光合色素含量的這種變化趨勢(shì)，與二月蘭(Orychophragmusviolaeeus)、玉米(Zeamays)的葉綠素含量的變化規(guī)律完全吻合[24-25]。另一方面，我們卻發(fā)現(xiàn)葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fo、Fv/Fm、qP和qN以及反映膜脂過氧化程度的MDA含量與對(duì)照相比卻無顯著變化(表1，圖2)，這可能是大量Cr3+干擾原有離子間的平衡系統(tǒng)，致使PSⅡ反應(yīng)中心不可逆失活，引起Fo增加，QA處于氧化還原狀態(tài)，F(xiàn)v隨光合活性而變化，為了保護(hù)PSⅡ免遭破壞，非輻射能量耗散也隨之增強(qiáng)，因此qP上升，qN下降，我們猜測(cè)也許是防御PSⅡ過量激發(fā)或結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷的某種機(jī)制，或是細(xì)胞內(nèi)積累的Cr3+通過其他方式影響植物的生理生化活動(dòng)，與部分大分子物質(zhì)結(jié)合，取代了某些必需的特定元素，使其變性或活性降低，這也可從較低水平的MDA得到印證。作為檢測(cè)植物受逆程度的重要指標(biāo)，多數(shù)的研究結(jié)果表明，脅迫環(huán)境下植物的MDA含量常常高于正常生境中的植物。然而，在極高脅迫環(huán)境下 MDA含量的變化規(guī)律研究尚少。在本實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cr3+脅迫下的濃度升至500 mmol/L時(shí)，MDA含量與對(duì)照組的含量相比并沒有顯著變化，這與前人的結(jié)果似乎并不一致[4-6]。

另一方面，部分研究也發(fā)現(xiàn)了植株MDA含量在高脅迫下呈現(xiàn)降低現(xiàn)象。如高麗萍等[26]在獼猴桃(Actinidiachinensis)的衰老試驗(yàn)中，觀察到MDA 含量先升后降。此外，覃鵬等[27]的研究也證實(shí)了在干旱脅迫下各個(gè)煙草(Nicotianatabacum)品種(系)的MDA含量總體上隨著干旱脅迫的不斷加重而呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，其原因估計(jì)是高脅迫程度下植株嚴(yán)重受害，葉片全部萎蔫而不能進(jìn)行正常的生物合成，反而不斷消耗干物質(zhì)，導(dǎo)致MDA不僅不能產(chǎn)生，甚至處于持續(xù)的降解之中，所以隨著干旱處理的加重而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。多數(shù)的研究認(rèn)為，鉻可引起永久性的質(zhì)壁分離并使植物組織失水，高濃度的鉻對(duì)線粒體的傷害是不可逆轉(zhuǎn)的，將造成呼吸作用降低，甚至植物細(xì)胞死亡[28-30]。因此，我們推測(cè)高濃度鉻脅迫導(dǎo)致植株根部細(xì)胞發(fā)生永久性的質(zhì)壁分離并使植物組織失水，植物體內(nèi)的代謝過程發(fā)生紊亂，化學(xué)成分發(fā)生改變，引起部分細(xì)胞的死亡，最終導(dǎo)致MDA含量不僅沒有隨脅迫加強(qiáng)而繼續(xù)增高，而是相應(yīng)地發(fā)生了降解，造成含量降低。在實(shí)驗(yàn)中我們觀測(cè)到高濃度鉻脅迫下植株在7 d內(nèi)很快出現(xiàn)萎蔫的現(xiàn)象，這也間接地證明了推測(cè)的合理性。

綜上所述，低濃度Cr3+脅迫可以通過促進(jìn)PSⅡ電子傳遞活性來增加葎草幼苗的凈光合速率，從而在一定程度上促進(jìn)植株生長(zhǎng)。中等濃度Cr3+脅迫則嚴(yán)重影響了植株氣孔的擴(kuò)張行為，降低了光合色素含量，同時(shí)減弱了PSⅡ反應(yīng)中心開放程度以及光合電子的傳遞速度，從而導(dǎo)致葎草幼苗的凈光合速率顯著下降，植株生長(zhǎng)受到抑制。高濃度Cr3+脅迫則能導(dǎo)致植物體內(nèi)的代謝過程發(fā)生紊亂，引起部分細(xì)胞的死亡，光合色素含量下降，凈光合速率降到最低，植株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響。此外，由于Cr3+毒害是多方面的，其抗性機(jī)理十分復(fù)雜，Cr3+脅迫影響植株生長(zhǎng)的關(guān)鍵途徑及因素還有待進(jìn)一步深入研究。