馬 瑜，李 勃，張育輝

1. 陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 秦巴山區(qū)可持續(xù)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 710062 2. 陜西省微生物研究所，西安 710043

近年來(lái)，兩棲動(dòng)物種群數(shù)量不斷下降，其原因之一是由于殺蟲劑、除草劑等化學(xué)農(nóng)藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的濫用導(dǎo)致土壤、地下及地表水源的持續(xù)污染[1-2]，進(jìn)而對(duì)整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響[3-4]，嚴(yán)重威脅兩棲類的生存。有機(jī)磷農(nóng)藥是繼有機(jī)氯農(nóng)藥被禁止使用后目前應(yīng)用最為廣泛的一類殺蟲劑，它們可直接殺死兩棲動(dòng)物，也可通過影響其生殖行為、降低孵化率及引起免疫抑制而間接影響兩棲類種群數(shù)量[5]。

敵百蟲(trichlorfon)，化學(xué)名O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯，是我國(guó)目前應(yīng)用較為廣泛的一種有機(jī)磷殺蟲劑，由于其廣譜、高效、低毒等特點(diǎn)而被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)、種植業(yè)及加工業(yè)之中[6]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，0.1～1.0 mg·L-1敵百蟲通常用于防治水生昆蟲對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象的疾病感染和蠕蟲的體外寄生，同時(shí)也可用于控制水體中的浮游生物[7-9]。但長(zhǎng)期反復(fù)使用敵百蟲，將導(dǎo)致殺蟲劑殘留在水體及淤泥中富集，造成水域化學(xué)污染，對(duì)魚、蟹、蝦類等非靶標(biāo)生物中的有益生物產(chǎn)生直接毒性[10-12]。

有關(guān)敵百蟲對(duì)魚、蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的急性和慢性毒理學(xué)研究目前已有報(bào)道[13-15]，但有關(guān)水域中有機(jī)磷殺蟲劑對(duì)兩棲動(dòng)物幼體的生長(zhǎng)發(fā)育影響的相關(guān)研究仍較少。兩棲動(dòng)物的胚胎及幼體發(fā)育過程均在水域中進(jìn)行，其皮膚對(duì)水體中的離子等化學(xué)物質(zhì)具有較高的滲透性，因而水體中有毒物質(zhì)很容易影響胚胎及幼體的發(fā)育[16]。因此，兩棲動(dòng)物可作為檢測(cè)水域化學(xué)污染效力的理想材料之一，其生態(tài)分布也可作為環(huán)境污染程度的指示種群[17]。

中國(guó)林蛙(Ranachensinensis)是廣泛分布于中國(guó)北方各地的重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，近年來(lái)受棲息地水源生態(tài)環(huán)境污染的脅迫，野生種群數(shù)量急劇下降。本研究以野生中國(guó)林蛙蝌蚪為研究對(duì)象，通過急性毒性試驗(yàn)，獲得敵百蟲對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪的毒性指標(biāo)。然后，將蝌蚪長(zhǎng)時(shí)間暴露于安全濃度(SC)以下或略高于SC的低濃度敵百蟲水體中，觀察敵百蟲對(duì)蝌蚪生長(zhǎng)發(fā)育的影響，探討水體中以敵百蟲為代表的新型低毒類有機(jī)磷農(nóng)藥污染對(duì)兩棲動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的毒性，為進(jìn)一步深入研究其毒理機(jī)制提供資料，同時(shí)也為兩棲動(dòng)物生殖環(huán)境的保護(hù)、水生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)以及水域污染的治理提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材 料

中國(guó)林蛙(Ranachensinensis)受精卵采集于2013年3月陜西省西安市大峪水庫(kù)附近，實(shí)驗(yàn)室孵化，孵化水溫20±2 ℃，pH 6.8～7.0，鹽度1.8～1.9 g·L-1。待蝌蚪發(fā)育至Gosner 28～29期[18]，選用大小一致的蝌蚪進(jìn)行水體暴露實(shí)驗(yàn)。敵百蟲(90%晶體，湖北沙隆達(dá)公司)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 急性毒性試驗(yàn)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)10、15、20、25、30 mg·L-1敵百蟲共5個(gè)濃度組，設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組。處理和對(duì)照均設(shè)2個(gè)平行組，每組20只蝌蚪，每個(gè)處理濃度共40例。采用靜水連續(xù)暴露，實(shí)驗(yàn)的前8 h連續(xù)觀察，隨后在12、24、48、72和96 h觀察并記錄蝌蚪的中毒癥狀和死亡數(shù)，并及時(shí)清理死亡蝌蚪。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣2 d以上的自來(lái)水，24 h更換1次，急性毒性實(shí)驗(yàn)期間禁食。

1.3 慢性毒性試驗(yàn)

在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在零致死濃度(LC0)以下設(shè)0.2、0.5、1.0和2.0 mg·L-1敵百蟲共4個(gè)暴露濃度，設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組。處理和對(duì)照均設(shè)兩個(gè)平行組，每組20只蝌蚪，每個(gè)處理濃度共40例。暴露水溫20±3 ℃，每48 h換1次水并重新加藥，加藥4 h后投食，飼喂蛋黃、新鮮蔬菜和豬肝。實(shí)驗(yàn)前受試蝌蚪為28～29期，體重0.0856±0.0057 g，體長(zhǎng)(從吻端至泄殖腔)7.012±0.14 mm。每天觀察并記錄蝌蚪的死亡和畸形數(shù)。分別在暴露28和42 d時(shí)，測(cè)量體重及體長(zhǎng)，最后統(tǒng)計(jì)從暴露開始到75%的個(gè)體完全變態(tài)所用的時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

急性毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用線性回歸法處理，計(jì)算敵百蟲分別在24、48、72和96 h對(duì)蝌蚪的零致死濃度(LC0)、半致死濃度(LC50)和全致死濃度(LC100)，安全濃度(SC)采用公式：SC=96 h LC50×0.1計(jì)算。慢性毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件處理，用單因子方差分析(one-way ANOVA)檢測(cè)不同濃度組蝌蚪的體重、體長(zhǎng)及變態(tài)時(shí)間的差異顯著性。數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 敵百蟲對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪的急性毒性

2.1.1 蝌蚪的中毒癥狀

中國(guó)林蛙蝌蚪被暴露于含敵百蟲的水體中后，立即表現(xiàn)出騷動(dòng)不安，不斷浮出水面，游速加快。在25和30 mg·L-1組，蝌蚪暴露6 h后開始出現(xiàn)中毒癥狀，臥于水底或側(cè)仰游動(dòng)，對(duì)玻棒觸之的刺激反應(yīng)遲緩，僅原地游動(dòng)。在10、15、20 mg·L-1組，蝌蚪暴露12 h后出現(xiàn)中毒癥狀。暴露24 h，部分蝌蚪游動(dòng)中平衡失調(diào)，有的尾部彎曲與身體呈一定角度。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)外來(lái)刺激的反應(yīng)愈發(fā)遲緩，似喪失知覺。在30 mg·L-1組，暴露24 h后出現(xiàn)蝌蚪死亡，在25、20和15 mg·L-1組，暴露48 h出現(xiàn)死亡，在10 mg·L-1組，72 h出現(xiàn)死亡。蝌蚪死亡后尾部多呈彎曲狀，仰翻，外觀浮腫、膨大。蝌蚪死亡后2 h內(nèi)解剖觀察，其鰓腔內(nèi)充水，內(nèi)鰓萎縮，肝臟、腸管和腎臟呈灰白色。

2.1.2 蝌蚪的死亡率

統(tǒng)計(jì)分析不同濃度敵百蟲水體與蝌蚪死亡率的關(guān)系，在相同暴露時(shí)間，蝌蚪的死亡率隨著敵百蟲濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高(圖1)。蝌蚪暴露在含敵百蟲的水體中的死亡數(shù)和死亡率，用線性回歸法計(jì)算敵百蟲在24、48、72及96 h對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪的零致死濃度(LC0)、半致死濃度(LC50)、全致死濃度(LC100)及安全濃度(SC)，并通過回歸分析得出中國(guó)林蛙蝌蚪死亡幾率與敵百蟲濃度的回歸方程(表1)。

2.2 敵百蟲對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪生長(zhǎng)的影響

在慢性毒性試驗(yàn)中，蝌蚪在不同濃度敵百蟲水體和對(duì)照組中暴露21 d和42 d，對(duì)其體重、體長(zhǎng)及全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量并統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果顯示(圖2)，暴露21 d，與對(duì)照組相比，1.0、2.0 mg·L-1組蝌蚪的體重增長(zhǎng)較慢(p<0.05)，其余處理組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(p>0.05)。在暴露42 d，與對(duì)照組相比，各敵百蟲處理組蝌蚪體重增加均受到抑制，其中，0.2、0.5 mg·L-1組效應(yīng)顯著(p<0.05)，1.0、2.0 mg·L-1組蝌蚪效應(yīng)極顯著(p<0.01)。

圖1 敵百蟲濃度與中國(guó)林蛙蝌蚪死亡率的關(guān)系Fig. 1 Relationship between trichlorfon concentration and death ratio of tadpoles Rana chensinensis

表1 中國(guó)林蛙蝌蚪暴露于敵百蟲中死亡幾率與敵百蟲濃度的回歸分析Table 1 Regress equation between death probability of tadpoles Rana chensinensis and trichlorfon concentration

注：y，死亡率幾率值；x，敵百蟲濃度；b，回歸系數(shù)；a，截距。 Note:y, death probability value;x, trichlorfon concentration; b, regression coefficient; a, intercept.

蝌蚪體長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與體重統(tǒng)計(jì)結(jié)果相似(圖3)，在暴露21 d，與對(duì)照組相比，1.0、2.0 mg·L-1組中國(guó)林蛙蝌蚪的體長(zhǎng)增加較慢(p<0.05)，其余處理組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(p>0.05)。暴露42 d，與對(duì)照組相比，各敵百蟲處理組蝌蚪的體長(zhǎng)增加均受到抑制，0.2、1.0 mg·L-1組效應(yīng)顯著(p<0.05)，1.0、2.0mg·L-1組效應(yīng)極顯著(p<0.01)。

比較蝌蚪暴露于不同濃度敵百蟲后的體重和體長(zhǎng)的變化，其規(guī)律趨于一致?？梢姅嘲傧x對(duì)蝌蚪生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)在一定濃度范圍呈劑量效應(yīng)，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效應(yīng)逐漸顯著，呈現(xiàn)時(shí)間累積效應(yīng)規(guī)律。

2.3 敵百蟲對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪發(fā)育的影響

在慢性毒性試驗(yàn)中，統(tǒng)計(jì)不同濃度敵百蟲處理組蝌蚪從開始暴露的28～29期到75%個(gè)體完全變態(tài)所需時(shí)間、死亡率及致畸率。結(jié)果顯示，2.0 mg·L-1組蝌蚪一直未達(dá)到75%個(gè)體完全變態(tài)，其它各敵百蟲處理組與對(duì)照組相比，75%個(gè)體完全變態(tài)時(shí)間有不同時(shí)間的滯后(表2)。各敵百蟲處理組中蝌蚪的死亡率和畸形率均高于對(duì)照組(表2)?；沃饕憩F(xiàn)為尾巴彎曲，腹部膨大呈透明狀，其內(nèi)臟清晰可辨，個(gè)別個(gè)體后肢肥大或前肢缺失(圖4)。

圖2 中國(guó)林蛙蝌蚪暴露于不同濃度敵百蟲中體重的變化注：與對(duì)照比較，*p<0.05，**p<0.01。下同。Fig. 2 Weight of tadpoles Rana chensinensis exposed to different concentrations of trichlorfonNote: *p<0.05，**p<0.01, compared with the control. Similarly hereinafter.

圖3 中國(guó)林蛙蝌蚪暴露于不同濃度敵百蟲中體長(zhǎng)的變化Fig. 3 Length of tadpoles Rana chensinensis exposed to different concentrations of trichlorfon

表2 中國(guó)林蛙蝌蚪暴露于不同濃度敵百蟲后的變態(tài)時(shí)間、死亡率和畸形率Table 2 Death, abnormality ratio and metamorphosis time of tadpoles Rana chensinensis exposed to trichlorfon

注：-未完全變態(tài)。

Note:-has not been metamorphosis.

圖4 中國(guó)林蛙蝌蚪暴露于敵百蟲發(fā)生的畸形注：A，正常中國(guó)林蛙蝌蚪；B，尾部彎曲；C，腹部水腫；D，臟器呈灰白色；E，胸部膨大透明；F，變態(tài)后正常幼蛙；G，后肢肥大且前肢缺失。標(biāo)尺=5 mm。Fig. 4 Abnormality of tadpoles Rana chensinensis exposed to trichlorfonNote: A, normal tadpoles R. chensinensis; B, tail bent; C, abdominal swelling; D, organs off-white; E, chest swelled and transparent; F, normal froglets Rana chensinensis; G, hindlegs hypertrophy and foreleg missing. Bar=5 mm.

3 討論(Discussion)

3.1 敵百蟲對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪的急性毒性

作為有機(jī)磷酸酯類殺蟲劑，敵百蟲的主要致毒作用是經(jīng)機(jī)體吸收后與骨骼肌突觸及肌肉神經(jīng)接點(diǎn)的膽堿酯酶結(jié)合，形成不易水解的磷?；憠A酯酶，從而抑制膽堿酯酶的活性，導(dǎo)致乙酰膽堿在突觸內(nèi)蓄積，致使神經(jīng)突觸傳導(dǎo)中斷，引起生物神經(jīng)功能紊亂，誘發(fā)中毒癥狀，被廣泛用于農(nóng)作物保護(hù)和害蟲防治、生物體內(nèi)外寄生蟲的殺滅，也被用于治療阿爾茨海默癥[12,13,19,20]。除了引起抗膽堿酯酶作用，敵百蟲對(duì)機(jī)體的毒性還包括對(duì)抗氧化防御體系造成影響，改變機(jī)體抗氧化激酶的活性，誘發(fā)體內(nèi)、外的氧化應(yīng)激反應(yīng)[21-22]。

在本實(shí)驗(yàn)，中國(guó)林蛙蝌蚪的死亡率隨著水體中敵百蟲的濃度增加及暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。中毒瀕死的蝌蚪均呈現(xiàn)側(cè)翻游動(dòng)、并頻繁出現(xiàn)肌肉抽搐等典型的神經(jīng)中毒癥狀。死亡后尾部多呈強(qiáng)直性彎曲狀，仰翻，外觀浮腫、膨大。通過解剖觀察，多數(shù)中毒致死的蝌蚪鰓腔內(nèi)充水，內(nèi)鰓萎縮，其肝臟、腎臟及腸管發(fā)生病變呈灰白色，說(shuō)明除典型的神經(jīng)毒性作用外，敵百蟲還可能引起蝌蚪內(nèi)臟的氧化損傷。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，中國(guó)林蛙蝌蚪在含敵百蟲的水體暴露24、48、72、96 h后的LC50分別為142.50±3.23、49.19±1.28、25.68±2.04和15.55±1.933 mg·L-1，其變化范圍較大，表明敵百蟲可在蝌蚪體內(nèi)聚集，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生直接毒性損傷，使得LC50在短時(shí)間內(nèi)大幅度降低。其SC為1.56±0.19 mg·L-1，可見敵百蟲對(duì)蝌蚪有較強(qiáng)的急性毒性。

近年來(lái)，由于對(duì)農(nóng)藥殘留污染問題的日益重視，對(duì)于像敵敵畏、甲胺磷、三唑磷等對(duì)人及哺乳動(dòng)物具有較強(qiáng)毒性的有機(jī)磷殺蟲劑正在逐步被禁用，而對(duì)較低毒性的敵百蟲則使用愈發(fā)廣泛。與此同時(shí)，敵百蟲對(duì)于非靶標(biāo)生物的安全性問題也正在受到關(guān)注[23]。據(jù)報(bào)道，用含極低劑量敵百蟲殘留的飼料飼養(yǎng)草魚，雖然不影響其進(jìn)食量和存活率，但會(huì)引起草魚生理反應(yīng)的改變，如乙酰膽堿酯酶活性降低，引起肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而且對(duì)疾病的易感性增加[23]。研究已表明，敵百蟲對(duì)于水生生物的毒性具有較大差異。例如，對(duì)斑馬魚幼體和成體而言，其96 h的LC50分別為25.4和28.8 mg·L-1[24]，另一報(bào)道敵百蟲對(duì)斑馬魚和鯽魚96 h的LC50值為52.50、58.29 mg·L-1[25]，而對(duì)于沼澤綠牛蛙(Ranagrylio)蝌蚪的96 h LC50值為7.94 mg·L-1[26]，本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定敵百蟲對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪的96 h LC50值為15.5 mg·L-1。盡管由于不同物種的生物學(xué)特性、原生活環(huán)境以及所處發(fā)育階段的不同，可能導(dǎo)致有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有一定的差異，但對(duì)于發(fā)育中的兩棲類幼體，敵百蟲的毒性仍是顯著的。所以，所謂敵百蟲的“低毒”只能是對(duì)人或大型的哺乳動(dòng)物而言。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖以及田間施藥中所使用的建議劑量將無(wú)疑對(duì)兩棲動(dòng)物的繁殖和生存造成嚴(yán)重威脅。因此對(duì)于敵百蟲及其類似低毒類的有機(jī)磷殺蟲劑對(duì)非靶標(biāo)水生生物毒性的深入研究，對(duì)完善農(nóng)藥對(duì)水體及水源涵養(yǎng)地生態(tài)安全的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估顯得尤為重要。

3.2 敵百蟲對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪生長(zhǎng)發(fā)育的影響

低劑量有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)于水生動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的毒理機(jī)制研究已有報(bào)道。如在羅非魚(Oreochromisniloticus)，0.25 ppm敵百蟲暴露72 h即可引起鰓的水腫和充血，直接影響魚體重的增長(zhǎng)[11]。敵百蟲可抑制魚類胚胎和幼體的正常發(fā)育過程，導(dǎo)致發(fā)育畸形，甚至死亡。不同濃度敵百蟲水體可降低斑馬魚胚胎的色素沉積，并影響孵化率和卵黃蛋白原吸收率，其效應(yīng)呈現(xiàn)劑量和時(shí)間的依賴性。高劑量的敵百蟲(160 mg·L-1)暴露2 d可引起89.6%的胚胎死亡，而較低劑量(20 mg·L-1)敵百蟲暴露3 d則引起幼體心包產(chǎn)生水腫，并且氧化應(yīng)激過程中關(guān)鍵代謝酶活性發(fā)生變化，誘發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，這可能是敵百蟲對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性的機(jī)制之一[24-25]。在本實(shí)驗(yàn)，蝌蚪在SC以下的敵百蟲水體中連續(xù)暴露，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育仍具有不同程度的抑制作用，說(shuō)明敵百蟲在SC以下的低劑量持續(xù)暴露也會(huì)對(duì)蝌蚪生存構(gòu)成脅迫。在濃度為0.2 mg·L-1，體重和體長(zhǎng)的增長(zhǎng)也受到不同程度抑制。在濃度大于1.0 mg·L-1暴露21 d，蝌蚪的體長(zhǎng)和體重增長(zhǎng)均被顯著抑制。在暴露42 d時(shí)，所有處理組蝌蚪的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制。可見在SC以下的敵百蟲對(duì)于蝌蚪生長(zhǎng)的抑制隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈累積效應(yīng)，與已有研究結(jié)果所得結(jié)論一致。

在慢性實(shí)驗(yàn)過程中，隨著敵百蟲劑量的增加，蝌蚪的死亡率升高。在濃度1.0 mg·L-1組在75%個(gè)體變態(tài)后，死亡率已達(dá)56%，在濃度略高于SC 的2.0 mg·L-1組，其死亡率達(dá)到78%。統(tǒng)計(jì)蝌蚪完成變態(tài)所需時(shí)間，經(jīng)敵百蟲處理后，各組蝌蚪變態(tài)所用的時(shí)間均滯后，而且 2.0 mg·L-1組未達(dá)到75%的個(gè)體變態(tài)就大部分死亡。觀察可見，在SC以下的敵百蟲水體中，在蝌蚪發(fā)育的各個(gè)期，敵百蟲均可導(dǎo)致蝌蚪產(chǎn)生畸型，表現(xiàn)為身體扭曲、尾部強(qiáng)直性彎曲、腹部膨大、肢體缺失或畸形等。在略高于SC的2.0 mg·L-1水體中，這一現(xiàn)象更為嚴(yán)重。其原因可能是蝌蚪體壁結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，水體中敵百蟲容易滲透作用進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)并累積，通過抑制膽堿酯酶活性，導(dǎo)致乙酰膽堿蓄積，從而發(fā)生肌肉強(qiáng)直收縮，由于肌肉強(qiáng)直收縮導(dǎo)致身體扭曲或彎曲，蝌蚪無(wú)法自由游動(dòng)及攝食，最終死亡。其實(shí)質(zhì)應(yīng)為神經(jīng)性中毒[27]。

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