張 帆，白 玲，郭瑞子，馬 驛，孫永學,*

1. 國家獸藥安全評價(環(huán)境評估)實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學，廣州 510642 2. 廣東海洋大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，湛江 524088

洛克沙胂(roxarsone)是一種有機胂類化合物，作為畜禽專用抗菌、促生長的飼料添加劑已在我國得到廣泛使用，研究表明，畜禽攝入有機胂添加劑后在胃腸道吸收少、體內(nèi)蓄積時間很短、殘留量低，80%～90%以原形通過糞便排泄到體外。一個養(yǎng)殖規(guī)模為2億羽肉雞場，每年向環(huán)境排放8 t以上的砷[1]。獸藥隨動物糞、尿等排泄物進入生態(tài)環(huán)境，污染環(huán)境土壤、表層水體等，并通過食物鏈影響植物、動物和微生物的正常生命活動，或在植物中富集，最終將影響人類的健康[2-3]。洛克沙胂污染土壤后使其質(zhì)量降低，農(nóng)作物產(chǎn)量減少，最終經(jīng)過土壤物質(zhì)循環(huán)降解可能轉(zhuǎn)化成無機砷形式而造成更嚴重的危害。

土壤中的磷脂大部分以活體生物的組分形式出現(xiàn)，磷脂脂肪酸(PLFA)即為甲基化土壤中提取磷脂成分后得到的脂肪酸產(chǎn)物，它具有屬的特異性，不同的微生物能夠通過不同生化途徑形成不同的PLFA，根據(jù)不同微生物特定磷脂脂肪酸標記物的種類和組成比例可了解土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化[4]。相對于傳統(tǒng)的微生物學分析方法，磷脂脂肪酸分析技術是一種不需要通過分離和培養(yǎng)土壤微生物，并且能更全面揭示土壤中微生物的生物量和生態(tài)結(jié)構(gòu)，是一種更為快速、簡便、精確的微生物分析方法[5]。PLFA技術被廣泛運用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分析中，可動態(tài)檢測土壤污染暴露與恢復過程中微生物的變化，為污染土壤的修復提供理論科學依據(jù)[6-7]。本試驗通過在土壤中添加不同濃度洛克沙胂，借助磷脂脂肪酸方法，分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化特征，明確土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性類型的差異程度，了解洛克沙胂對土壤微生物群落的影響強度，探索洛克沙胂污染與土壤微生物細胞指標之間的內(nèi)在聯(lián)系，以揭示洛克沙胂在環(huán)境中殘留對土壤微生物學性狀的影響，為評估和監(jiān)控洛克沙胂對土壤環(huán)境的早期污染和生態(tài)毒理學效應提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材 料

洛克沙胂原料藥，含量98.5%，購自廣州惠華動物保健品有限公司。土壤采自華南農(nóng)業(yè)大學試驗田20～100 cm 土層的勻質(zhì)土壤，色深，質(zhì)細，基本理化性狀為：有機碳48.35±3.52 g·kg-1，總氮2.38±0.19 g·kg-1，總磷12.27±1.99 g·kg-1，總鉀0.15±0.04 g·kg-1，pH 6.2±0.55。供試土壤未檢測出洛克沙胂殘留。

1.2 方 法

1.2.1 土壤處理

新鮮土樣過4 mm篩后于室溫下放置3 d，分裝到5 L的塑料桶中，每桶裝3 kg鮮土，按每3 kg鮮土加入50 mL不同濃度的洛克沙胂溶液混勻，使藥物含量分別為(以As計)：Ⅰ組15 mg·kg-1、Ⅱ組75 mg·kg-1、Ⅲ組150 mg·kg-1，每處理設3次重復。將土壤含水量調(diào)至飽和持水量的50%，并用濕布蓋于土表，置于室溫(20 ℃～25 ℃)下培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中為了保持土壤濕度不變，損失的水分通過稱重法補充。各組設3個重復。于處理后第1、2、3、5、8周分別采取培養(yǎng)土壤進行分析。

1.2.2 磷脂脂肪酸法測定土壤微生物群落

1.2.2.1 磷脂脂肪酸分離和提取步驟：取5 g土壤分別加入 4.0 mL 磷酸緩沖液、5.0 mL 氯仿、10 mL甲醇，震蕩 2 h，2 500 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，再向土壤中加入相同體積的磷酸緩沖液、氯仿和甲醇溶液，震蕩1 h，離心，合并2 次上清液，氮氣吹干，過硅膠柱，洗脫液依次采用氯仿5 mL，丙酮10 mL，甲醇5 mL。收集甲醇相，氮氣吹干。 再加入 0.2 mol·L-1的氫氧化鉀、甲醇各1 mL，最后用正己烷萃取，收集正己烷相，定容至 100 μL，用于氣相色譜質(zhì)譜儀的測定。

1.2.2.2 氣相質(zhì)譜條件設置：2010QP ，GC-MS聯(lián)用儀GC分析條件：色譜柱為DB5MS，進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，采用無分流形式，流速0.8 mL·min-1。升溫程序：100 ℃保溫1 min；100 ℃～190 ℃ 1 min升溫 5 ℃；190 ℃ 保溫1 min；190 ℃～230 ℃ 1 min 升溫 3 ℃；230 ℃ 保溫1 min；230 ℃～290 ℃ 1 min 升溫10 ℃；290 ℃ 保溫2 min。

1.2.2.3 磷脂脂肪酸的鑒定：磷脂脂肪酸(PLFA)的鑒定見有關方法[8]。脂肪酸的命名以脂肪酸碳總數(shù)開始，常用的命名格式為X:YωZ(c/t)，其中，X是總碳數(shù)，后面跟一個冒號，Y表示雙鍵數(shù)，ω表示甲基末端，Z是距離甲基端的距離，c表示順式空間構(gòu)造，t表示反式空間構(gòu)造，前綴“i”和“a”代表支鏈的順式異構(gòu)和反式異構(gòu)，“Me”代表甲基，“OH”代表羥基，“cy”代表環(huán)丙基。脂肪酸含量測定以正十九烷脂肪酸甲酯(19:0)為內(nèi)標，色譜峰面積定量。細菌總生物量以PLFA i15:0，a15:0，15:03OH，il6:0，16:1ω7c，16:1ω9c，a17:0，il7:0, cyl7:0，18:1ω7c，cyl9:0之和估算；革蘭氏陰性菌生物量以16:1ω7c，16:1ω9c，cyl7:0，18:1ω7c，cyl9:0之和估算；革蘭氏陽性菌生物量以i15:0，al5:0，15:03OH，il6:0，a17:0，il7:0之和估算；真菌生物量根據(jù) 18:2ω6，18:1ω9c 的總濃度來估算；放線菌生物量根據(jù)18:10Me的總濃度來估算[9-11]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2007 處理數(shù)據(jù)，SPSS 11.5 軟件進行統(tǒng)計分析和主成分分析，采用單因素方差分析檢驗不同處理之間的差異( LSD，α= 0.05)。所有數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤。

2 結(jié)果(Results)

2.1 磷脂脂肪酸各指標變化

第1周不同處理組土壤中各類磷脂脂肪酸的含量見表1，第1、2、3、5和8周洛克沙胂對土壤各類磷脂脂肪酸的影響見圖1。由圖1顯示定性與定量的17種磷脂脂肪酸(PLFAs)隨著洛克沙胂濃度增加各自變化的情況，與對照組相比，洛克沙胂處理的各濃度組檢測出的大多數(shù)脂肪酸都出現(xiàn)不同程度的減少，且17種脂肪酸的含量變化大多數(shù)與藥物濃度的變化成反比。

圖1 洛克沙胂對土壤各類磷脂脂肪酸的影響(A，用藥第1周；B，用藥第2周；C，用藥第3周；D，用藥第5周；E，用藥第8周)注：同磷脂脂肪酸生物標記數(shù)據(jù)無相同字母者，表示差異顯著(p<0.05)。Fig. 1 The effects of roxarsone treatments on each PLFA content (A, after treated with roxarsone 1 week; B, after treated with roxarsone 2 weeks; C, after treated with roxarsone 3 weeks; D, after treated with roxarsone 5 weeks; E, after treated with roxarsone 8 weeks)Note: the data in same PLFA biomarker without the same letter means have significant difference (p<0.05).

表1 第1周不同處理組土壤中各類磷脂脂肪酸的含量Table 1 The effects of roxarsone treatments on each PLFA content in the first week

2.2 PLFA總量及不同土壤微生物PLFA表征含量的變化

洛克沙胂處理組在不同采樣時間的土壤微生物PLFA總量變化見圖2。結(jié)果表明，在整個采樣周期里，每克土壤總的PLFA含量在洛克沙胂的影響下明顯減少，而且存在劑量依賴效應。第1、2、3、5、8周，添加洛克沙胂各組的PLFA總量均與對照組差異顯著(p<0.05)；第1、2、3、5周各組的PLFA總量隨著藥物作用時間的延長逐漸降低，第8周各組的PLFA總量開始增加。

洛克沙胂對不同土壤微生物的影響見表2，G+菌的PLFA表征含量比G-菌的含量高。第1、2、3、5、8周，添加洛克沙胂各組的G+菌的PLFA表征含量均與對照組差異不顯著；第1、2、3、5周，各組的G-菌的PLFA表征含量均與對照組差異顯著(p<0.05)，第8周，各組的G-菌的PLFA表征含量與對照組差異不顯著。結(jié)果表明，洛克沙胂的土壤暴露脅迫對G-菌的抑制作用比對G+菌和放線菌的抑制作用強，不同時間各種濃度的藥物處理對G+菌和放線菌的影響變化不明顯，對G-菌的影響在試驗后期(第8周)開始減弱。不同采樣時間低濃度組(w=15 mg·kg-1)的真菌PLFA表征含量均與對照組差異不顯著，高濃度洛克沙胂(w=150 mg·kg-1)使真菌PLFA顯著降低，第1、2、3、5、8周，高濃度處理組的真菌PLFA含量分別是對照組PLFA含量的56.46%、19.80%、57.02%、62.32%和57.30%。

圖2 不同處理的磷脂脂肪酸總量注：同采樣時間數(shù)據(jù)無相同字母者，表示差異顯著(p<0.05)。Fig. 2 Contents of total PLFAs contents for each treatmentNote: the data in same time without the same letter means have significant difference (p<0.05).

表2 第1周不同處理組土壤中各類磷脂脂肪酸的含量Table 2 Content of PLFA biomarker of different soil microorganisms for each treatment

注：同采樣時間數(shù)據(jù)無相同字母者，表示差異顯著(p<0.05)。

Note: the data in same time without the same letter means have significant difference (p<0.05).

2.3 磷脂脂肪酸的主成分分析

土壤微生物種群結(jié)構(gòu)是表征土壤生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的重要參數(shù)，17種脂肪酸的含量變化結(jié)果形成了描述微生物群落結(jié)構(gòu)特征的多元向量，不易直觀比較，對17種脂肪酸進行主成分分析結(jié)果表明：土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)多樣性類型差異明顯。

PC1解釋了微生物群落結(jié)構(gòu)變化中的變異程度(圖3), 第1周PC1為46.9%，得分系數(shù)(F3,8=73.9,p<0.001)，呈差異極顯著；第2周PC1為55.8%，得分系數(shù)(F3,8=73.9,p<0.05)，差異顯著；第3周PC1為58.3%，得分系數(shù)(F3,8= 57.92,p<0.001)，差異極顯著；第5周PC1為57.5%，得分系數(shù)(F3,8= 91.6,p<0.001)，差異極顯著；第8周PC1為62.5%，得分系數(shù)(F3,8= 76.46,p<0.001)，差異極顯著。由PLFA的結(jié)構(gòu)主成分分析可見，除了第1周時低濃度組(w=15 mg·kg-1)和對照組的PCA分析結(jié)構(gòu)差異不明顯以外，第2、3、5、8周時，各處理組的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)類型差異明顯(p<0.05)，各采樣點的高濃度處理組(w=150 mg·kg-1)與對照的差異最大(群落結(jié)構(gòu)相差最遠)。結(jié)果表明，培養(yǎng)前中期各濃度處理組之間都有明顯的類型差異，后期(第5、8周)差異不顯著。

圖3 不同處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主成分分析(A，用藥第1周；B，用藥第2周；C，用藥第3周；D，用藥第5周；E，用藥第8周)Fig. 3 Principal component analysis of soil microbial community structure from different treatments (A, after treated with roxarsone 1 week; B, after treated with roxarsone 2 weeks; C, after treated with roxarsone 3 weeks; D, after treated with roxarsone 5 weeks; E, after treated with roxarsone 8 weeks)

3 討論(Discussion)

磷脂脂肪酸分析技術是一種不需要經(jīng)過培養(yǎng)就能獲得土壤中微生物信息的方法，是通過提取微生物細胞膜中的磷脂成分，定量后得到總磷脂含量(單位：nmol·g-1)，是新興起來的一種表征微生物生物量的方法。磷脂脂肪酸是除古細菌外，幾乎所有微生物細胞膜磷脂的組成成分，具有屬的特異性，不同屬的微生物通過不同生化途徑而形成不同的PLFAs[12-13]，因此土壤中PLFAs組成和含量的變化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的動態(tài)變化。對其進行提取，并依據(jù)其中的特征脂肪酸指示的微生物種類，如細菌、真菌、放線菌及革蘭氏陽(陰)細菌等，可對土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)及其數(shù)量進行表征，可鑒別土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化。PLFA法分析得到的信息不僅可以表征微生物在量上的變化，還可以依據(jù)其中特征脂肪酸所指示的特定微生物類型的變化，揭示微生物群落結(jié)構(gòu)伴隨外界環(huán)境變化的響應動態(tài)[14-15]，如：農(nóng)田耕作措施或施肥作用影響下微生物群落結(jié)構(gòu)變化[16]，重金屬污染對于微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響和不同植被影響下微生物群落結(jié)構(gòu)的改變等[17]，可應用于動態(tài)檢測土壤污染與恢復過程中微生物的變化，為污染土壤的修復提供理論科學依據(jù)[18-19]。

關于土壤重金屬污染對微生物生態(tài)影響的研究較多，F(xiàn)rosteg?rd等[14]研究表明重金屬污染導致了土壤中 il5:0，il7:0，16:lω5，16:lω7等磷脂脂肪酸的減少，而 i16:0，brl7:0，brl8:0和cyl7:0等磷脂脂肪酸有所增加；閻姝等[20]研究顯示重金屬污染下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，細菌和真菌 PLFA 的變化幅度達到 30%以上，革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的脂肪酸比值升高。本實驗結(jié)果與以上所顯示的金屬污染土壤的PLFA結(jié)果存在異同。洛克沙胂的土壤暴露脅迫對G-菌的抑制作用比對G+菌和放線菌的抑制作用強，不同時間各種濃度的藥物處理對G+菌和放線菌的影響變化不明顯；不同采樣時間低濃度(w=15 mg·kg-1)處理組的真菌PLFA表征含量均與對照組差異不顯著，高濃度洛克沙胂(w=150 mg·kg-1)使真菌PLFA顯著降低。洛克沙胂本身具有殺菌和球蟲的作用，進入生態(tài)環(huán)境后最終會降解成可溶于水的無機砷類物質(zhì)，無機砷是毒性較大的類金屬。重金屬作為一種重要的常見污染物，對微生物的毒害作用主要表現(xiàn)在兩個方面，一是它們極易同一些生物大分子如酶的活性中心，以及極性電子基團如蛋白質(zhì)上的巰基、核苷酸上的堿基、磷酸基等結(jié)合，導致這些生物大分子失活；其次，金屬大都不能被生物分解，進入生物體內(nèi)后與金屬硫蛋白，類金屬硫蛋白和小分子量的配體如甘氨酸，?；撬岬冉Y(jié)合，極易在生物體內(nèi)蓄積，最終引起微生物死亡。土壤微生物數(shù)量減少，PLFA量即降低。

洛克沙胂PLFA主成分分析，明顯區(qū)分了不同濃度洛克沙胂影響下的群落結(jié)構(gòu)類型分異程度，具體表現(xiàn)在隨著污染程度的增加，其在主成分分布圖上向X軸的負方向延伸，洛克沙胂濃度越高則與對照組相距越遠；第1周時低濃度組與對照組差異不顯著，自第2周以后低濃度組與對照組可以明顯分開，說明隨著培養(yǎng)時間的延長洛克沙胂的毒性增強；在不同采樣時間，中、高濃度組與對照組各自明顯分開，差異顯著說明中高濃度洛克沙胂改變了土壤微生物結(jié)構(gòu)；第5、8周時，不同濃度洛克沙胂組相互間的結(jié)構(gòu)差異程度減輕。

實驗結(jié)果表明，洛克沙胂顯著降低了土壤微生物各類磷脂脂肪酸和PLFA總量，導致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分異明顯，且存在一定的劑量依賴效應，洛克沙胂濃度越高，∑PLFA越低，其中150 mg·kg-1的洛克沙胂處理影響最大。由此可見，洛克沙胂可致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性改變，暴露濃度越高其作用越強。原因是洛克沙胂殺菌而導致土壤微生物量降低，濃度越大殺菌能力越強。同時，洛克沙胂對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響還表現(xiàn)出時間差異，在暴露脅迫的早、中期(第1、2、3周)，對照組和各藥物處理組之間存在明顯的差異變化，在暴露脅迫的后期(第5、8周)，各藥物處理組間的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分異逐漸縮小，這可能是隨著時間延長，土壤中洛克沙胂逐漸降解或化學結(jié)構(gòu)改變，濃度降低，影響減弱，從而逐漸恢復土壤微生物生態(tài)平衡，也可能是土壤中一些對洛克沙胂有一定耐受性的細菌增殖，使微生物總量增加。

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